Vasostatin-1基因轉染抗心肌缺血-再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、目的：⑴構建和鑒定攜帶人嗜鉻粒蛋白A的N端1-76片段(CGA1-76)即Vasostatin-1(VS-1)基因的重組腺病毒表達載體，繼而觀察其轉染大鼠心肌細胞后的VS-1蛋白表達。⑵建立原代大鼠心肌細胞和大鼠主動脈內皮細胞(RAECs)培養(yǎng)的缺氧/復氧(H/R)損傷模型模擬體內缺血/再灌注損傷(MIRI)，觀察Ad-VS-1基因轉染抗心肌細胞和血管內皮細胞H/R損傷的作用。⑶構建大鼠心肌細胞和RAECs的H/R損傷模型模擬體內MIR

2、I，系統(tǒng)探討Ad-VS-1基因轉染抗心肌細胞和血管內皮細胞缺血/再灌注損傷作用的機制和通路。⑷建立大鼠心肌細胞—血管內皮細胞的Transwell微孔滲透共培養(yǎng)模型模擬體內心肌細胞/血管內皮細胞結構-功能關聯(lián)，建立H/R損傷模型模擬MIRI，探討共培養(yǎng)中VS-1基因轉染的心肌保護作用和由內皮細胞介導的心肌保護機制。 方法：①利用CGA1-58cDNA模版，設計引物，PCR合成、擴增CGA1-76cDNA并將其克隆至穿梭質粒pAd-

3、Track中，經(jīng)Pme I酶切線性化后與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1在大腸埃希菌BJ5183中同源重組。經(jīng)PCR、基因測序、酶切鑒定正確的同源重組質粒pAd-VS-1經(jīng)Pac I酶切線性化后轉染293細胞進行包裝、擴增得到重組腺病毒顆粒Ad-VS-1。②將Ad-VS-1轉染H9c2細胞并通過Western免疫印跡法檢測VS-1的蛋白表達。③.分別進行大鼠心肌細胞和大鼠主動脈內皮細胞(RAECs)的分離純化，并建立各自的H/R模型。④

4、建立大鼠原代心肌細胞和RAECs的H/R損傷模型，分設：空白組，H/R組，空載腺病毒轉染+H/R組，Ad-VS-1轉染+H/R組。⑤構建大鼠心肌細胞—RAECs微孔滲透Transwell共培養(yǎng)的H/R模型，同期構建單純心肌細胞培養(yǎng)的H/R模型為對照列。 結果：⑴鑒定證實VS-1基因重組質粒pAd-VS-1構建成功，將其導入293細胞包裝、擴增得到VS-1基因重組腺病毒Ad-VS-1。⑵Western印跡法證實Ad-VS-1轉染心

5、肌細胞并表達VS-1蛋白。⑶同空白對照組相比，H/R損傷導致心肌細胞和血管內皮細胞凋亡率增加，細胞活力顯著降低。⑷H/R損傷導致心肌細胞和血管內皮細胞膜通透性增加，SOD含量、eNOS、NO、Bcl-2蛋白表達顯著降低，MDA含量、ICAM-1、VCAM-1、TNF-a、NF-kB和Bax等細胞因子和蛋白表達顯著增加。⑸同單純心肌細胞培養(yǎng)的空載腺病毒轉染組的H/R損傷相比，共培養(yǎng)的相應組中的心肌細胞H/R損傷后細胞凋亡率和心肌酶譜(AS

6、T， CK-MB)顯著升高。 結論：①成功構建Ad-VS-1重組腺病毒，并證實其能有效轉染大鼠心肌細胞，穩(wěn)定表達VS-1蛋白。②VS-1基因轉染和表達在心肌細胞和血管內皮細胞具有顯著的抗H/R損傷作用。③Ad-VS-1基因轉染和表達的VS-1通過抑制氧自由基損傷、炎癥因子和細胞凋亡，促進NO保護作用以及PI3K/Akt，eNOS-NO-cGMP-PKG和P38MPAK信號轉導機制，產生預防細胞H/R損傷的心肌保護作用。④在共培養(yǎng)