轉(zhuǎn)錄因子FOXF1、NOTCH2和HNF6與人類肝癌的相關(guān)性研究.pdf

1、腫瘤發(fā)生機制的研究一直是腫瘤分子生物學(xué)中的一個重要研究領(lǐng)域，其中腫瘤相關(guān)基因的克隆和鑒定，不僅對腫瘤發(fā)生機制的研究具有重要的理論價值，而且對腫瘤的診斷和治療具有潛在的應(yīng)用價值。肝癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)生機制尚不完全清楚，現(xiàn)被認(rèn)為是多步驟多因素作用的結(jié)果，認(rèn)為與癌基因的激活和抑癌基因的失活等基因背景有關(guān)系。鑒定癌周肝組織與肝癌組織表達有差異的基因，可為肝癌的預(yù)防、診斷和治療提供有價值的候選基因。
　　 基于基因敲除后的表型分析及其

2、研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄因子HNF6調(diào)控中胚層轉(zhuǎn)錄因子Foxf1的表達，進而通過調(diào)控Foxf1的下游基因Notch2的表達而調(diào)控膽管的發(fā)育和生長。由于發(fā)現(xiàn)肝部分切除術(shù)后再生肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)HNF6表達上調(diào)，并且肝癌的發(fā)生，表現(xiàn)為順序出現(xiàn)的增生前和增生細(xì)胞群體，與正常細(xì)胞相比，其增殖行為發(fā)生明顯改變，同時伴有大量肝臟特異性蛋白質(zhì)的表達和活性改變。因此我們推測，上述轉(zhuǎn)錄因子在肝癌中也可能存在表達異常，基于上述考慮，本研究初步探索了上述3種轉(zhuǎn)錄因子

3、與肝癌發(fā)生，發(fā)展的相關(guān)性。
　　 一、Forkhead box(FOX)蛋白質(zhì)是一組進化上保守的轉(zhuǎn)錄因子超家族，以Forkhead DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域為共同結(jié)構(gòu)特征，調(diào)控廣泛的生物學(xué)過程。本研究通過收集手術(shù)切除的人類癌周肝組織、肝癌組織新鮮標(biāo)本，用Trizol試劑法提取各組織總RNA，通過OD260吸光度測定RNA濃度，各組織取等量RNA，通過隨機引物引導(dǎo)，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA產(chǎn)物，以cDNA為模

4、板，通過PCR法擴增FOXF1的基因片段。發(fā)現(xiàn)肝癌組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXF1的表達水平顯著低于癌周肝組織。上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過測序，證實與MEDLINE序列一致；將各樣本用含去垢劑NP-40的裂解液勻漿后提取組織總蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍G-250染色法測量蛋白濃度后，取等量蛋白質(zhì)上樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含牛血清白蛋白的封閉液進行封閉后，與稀釋的FOXF1多克隆抗體進行雜交，再與辣根過氧化

5、物酶標(biāo)記的二抗孵育，經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXF1的表達水平顯著低于癌周肝組織。免疫組織化學(xué)檢測，F(xiàn)OXF1在蛋白質(zhì)水平上的表達與上述結(jié)果一致。
　　 二、Notch轉(zhuǎn)錄因子其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在細(xì)胞分化、發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本研究采用RT-PCR法在各樣品中均觀察到Notch2在基因水平的表達，但在癌周肝組織與肝癌組織之間，未觀察到Notch2基因表達水平上的顯著差異。Western雜交法

6、未能在蛋白質(zhì)水平上檢測到各組織中Notch2的表達。免疫組織化學(xué)檢測，肝癌組織與癌周肝組織之間Notch2蛋白質(zhì)的表達水平?jīng)]有差異。
　　 三、HNF6是肝細(xì)胞豐富轉(zhuǎn)錄因子家族中較新的成員，可調(diào)控肝細(xì)胞特異性基因的表達，在肝臟增殖過程中HNF6表達水平明顯增高，在肝細(xì)胞的分化及功能維持上起重要作用。本研究通過RT-PCR法可在基因水平上檢測到各組織中HNF6的表達。Western雜交法可在蛋白質(zhì)水平上檢測到各組織中HNF6的表達

7、。結(jié)果表明，癌周肝組織與肝癌組織之間HNF6基因和蛋白質(zhì)表達水平無顯著差異。
　　 本研究結(jié)合免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western雜交技術(shù)，分別在基因和蛋白質(zhì)水平上初步探索了轉(zhuǎn)錄因子FOXF1、Notch2和HNF6在人類肝癌中的表達規(guī)律。在基因和蛋白質(zhì)水平上均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXF1在肝癌組織中的表達水平顯著下調(diào)，提示該因子可能在腫瘤抑制中發(fā)揮作用，與抑癌基因可能存在某種程度的相互作用，有可能成為腫瘤基因診斷新的篩選標(biāo)志和