Notch1及Notch2基因與阿爾茨海默病相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:本研究通過建立條件性敲除大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因小鼠[Notch1,Notch2,and Notch1/2 conditional knockout(cKO)mice],旨在探討 Notch1和/或 Notch2是否為早老素/γ分泌酶介導(dǎo)成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元存活的功能靶底物,及Notch1、Notch2基因與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)相關(guān)性的分子生

2、物學(xué)機制。
　　方法:使用了與條件性敲除早老素或 Nicastrin基因小鼠模型相同的技術(shù),如基因載體的構(gòu)建,胚胎干細胞的獲得,同源重組,選擇篩選已擊中的細胞,與αCaMKⅡ-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交等方法,獲得條件性敲除大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因小鼠[Notch1,Notch2,and Notch1/2 conditional knockout(cKO)mice],并使用PCR及Weste

3、rn blot方法檢測 Notch1/Notch2等位基因及其蛋白表達評價此三種基因敲除小鼠是否成功;運用尼氏染色、免疫組織化學(xué)及Western blot技術(shù)分析該模型小鼠大腦皮層形態(tài)、體積、神經(jīng)元數(shù)量、膠質(zhì)細胞增生等變化;運用Northern blot和Western blot技術(shù)分析 Notch1及Notch2的mRNAs及蛋白表達水平的變化。
　　結(jié)果:本研究建立的小鼠模型中,成功的在大腦皮層興奮性神經(jīng)元中發(fā)生了條件性敲除,

4、且當(dāng)原代培養(yǎng)的floxed Notch1/Notch2新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元中引入Cre重組酶后,Notch1及Notch2本來的高表達在3-4天后也完全消失,證明了Cre重組酶系統(tǒng)的有效性。我們并未在成年 Notch cKO小鼠模型(年齡約2歲)的大腦皮層中檢測到任何神經(jīng)退行性變化。在成年 Notch1,Notch2 cKO小鼠模型(年齡約2-3月)的大腦皮層中也未檢測到 Notch1及Notch2的mRNAs及蛋白質(zhì)水平的減退。

5、r>　　結(jié)論:以上實驗結(jié)果說明 Notch1及Notch2并不是早老素或γ分泌酶介導(dǎo)的神經(jīng)元存活的直接底物,并且 Notch1及Notch2受體蛋白并不或很少在成年小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中表達,未來的研究將集中在 Notch受體蛋白在除外興奮性神經(jīng)元的大腦其它細胞中的功能與 AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,及其它可能參與調(diào)節(jié)早老素/γ分泌酶影響神經(jīng)元存活的重要底物。
　　主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 條件性敲除小鼠大腦皮

6、層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因動物模型的建立及驗證
　　目的:建立條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因動物模型并進行驗證。
　　方法:通過基因載體的構(gòu)建,胚胎干細胞的獲得,同源重組,篩選細胞等方法獲得條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因動物模型,并使用PCR及Western blot技術(shù)進行驗證。

7、
　　結(jié)果:PCR檢測顯示 Floxed Notch1及Notch2等位基因準(zhǔn)確的在 Notch cKO小鼠的大腦皮層興奮性神經(jīng)元中敲除。當(dāng) Cre重組酶轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元(fNotch1/fNotch1; fNotch2/fNotch2)后,能有效的消除其中Notch1及Notch2受體蛋白的表達。
　　結(jié)論:PCR及Western blot檢測證明成功建立了條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1

8、、Notch2及Notch1/2基因的動物模型。
　　第二部分 條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因模型的組織學(xué)研究
　　目的:利用尼氏染色、免疫組織化學(xué)等實驗技術(shù)探討條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因模型是否存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化。
　　方法:分別使用尼氏染色、免疫組織化學(xué)、體視學(xué)及Western blot等實驗技術(shù)

9、,檢測條件性敲除 Notch1、Notch2及Notch1/2基因小鼠模型中大腦形態(tài)變化、神經(jīng)元數(shù)量及星形膠質(zhì)細胞的形成等。
　　結(jié)果:尼氏染色、免疫組織化學(xué)及Western blot等檢測結(jié)果顯示 Notch1、Notch2及Notch1/2 cKO小鼠具有大致正常的大腦形態(tài),未顯示大腦皮層萎縮及神經(jīng)元丟失(n=4/基因型, p>0.05),且并未發(fā)生星形膠質(zhì)細胞增生或者 GFAP水平上調(diào)。
　　結(jié)論:在成年小鼠中樞神經(jīng)系

10、統(tǒng)中,條件性敲除 Notch1、2基因后大腦皮層無明顯神經(jīng)退行性改變。
　　第三部分條件性敲除小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中Notch1及Notch2基因動物模型的分子生物學(xué)研究
　　目的:利用分子生物學(xué)技術(shù)探討 Notch1、2受體蛋白在 Notch1 cKO及Notch2 cKO小鼠大腦皮層興奮性神經(jīng)元中的表達及作用。
　　方法:應(yīng)用Western blot及Northern blot檢測條件性敲除 Notch1、No

11、tch2基因小鼠模型中Notch1和Notch2 mRNA水平及蛋白質(zhì)水平是否發(fā)生改變,及改變的程度。
　　結(jié)果:分子生物學(xué)檢測結(jié)果顯示,在條件性敲除 Notch1及Notch2基因小鼠的大腦皮層中Notch1、2 mRNA表達水平并未改變,Notch1、2蛋白質(zhì)表達水平也未改變,且應(yīng)用不同抗體檢測 Notch1、2蛋白質(zhì)表達水平也同樣未發(fā)生改變,與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:Notch1、2受體