缺氧誘導(dǎo)因子1-α和Notch1的關(guān)系及其在阿爾茨海默病中的研究.pdf

1、目的：研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HIF-1α和Notch1間的關(guān)系，并探討其在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：體外原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系，通過電穿孔轉(zhuǎn)染法沉默細(xì)胞中HIF-1α/ Notch1的基因表達(dá)，應(yīng)用RT-PCR及western blot方法檢測(cè)相應(yīng)Notch1/HIF-1α基因及蛋白水平的表達(dá)變化。應(yīng)用ADDLs干預(yù)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系，建立AD的體外細(xì)胞模型，應(yīng)用western b

2、lot方法檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)（4,小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)）不同條件下（空白對(duì)照組，空白對(duì)照+ADDLs組，沉默HIF-1α/Notch1組，沉默HIF-1α/Notch1+ADDLs組）細(xì)胞內(nèi)HIF-1α/ Notch1的表達(dá)情況。并檢測(cè)應(yīng)用ADDLs干預(yù)細(xì)胞后不同條件不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)情況。應(yīng)用APPSWE轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD模型鼠，建立缺氧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，應(yīng)用western blot方法檢測(cè)不同分組（野生型正常

3、氧組,野生型缺氧組，APPSWE正常氧組,APPSWE缺氧組）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、在小鼠體外原代皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，抑制HIF-1α/Notch1的表達(dá)會(huì)相應(yīng)的降低Notch1/HIF-1α的表達(dá)水平；2、在AD的體外細(xì)胞模型中，ADDLs促進(jìn)HIF-1α及Notch1的表達(dá)（無論是在空白對(duì)照組還是在基因沉默組，ADDLs均可上調(diào)這兩種條件下細(xì)胞內(nèi)HIF-1α/Not

4、ch1的表達(dá)水平），且HIF-1α與Notch1的表達(dá)水平變化呈正相關(guān)；3、抑制HIF-1α/Notch1的基因表達(dá)會(huì)相應(yīng)的降低ADDLs所誘導(dǎo)的這二者的增高趨勢(shì)；4、ADDLs使細(xì)胞內(nèi)caspase-3的表達(dá)明顯升高，但是抑制細(xì)胞內(nèi)HIF-1α或者Notch1的表達(dá)均可降低這種趨勢(shì)，但抑制HIF-1α/Notch1表達(dá)的這種保護(hù)作用隨著ADDLs作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱；5、在AD模型鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與野生型正常氧組的小鼠相比，APPSW

5、E正常氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α與Notch1的表達(dá)是增高的；6、在急性缺氧動(dòng)物模型中，急性缺氧的應(yīng)激條件使野生型小鼠和APPSWE小鼠腦內(nèi)的HIF-1α與Notch1的表達(dá)均明顯增高，且HIF-1α與Notch1的表達(dá)變化呈正相關(guān)，但野生型缺氧組小鼠HIF-1α與Notch1的表達(dá)增高程度更甚。
　　結(jié)論：1、無論是在正常培養(yǎng)條件下的體外原代神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系，還是ADDLs所誘導(dǎo)的AD體外細(xì)胞模型，還是在AD動(dòng)物模

6、型中HIF-1α和Notch1是密切相關(guān)的；2、HIF-1α/Notch1與ADDLs所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。也就是說，無論是在生理?xiàng)l件下還是在病理?xiàng)l件下，HIF-1α與Notch1均是密切相關(guān)，且二者參與了ADDLs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，可能在AD的發(fā)生發(fā)展過程有重要的作用。
　　第一部分：HIF-1α和Notch1在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系中的相互作用
　　目的：研究HIF-1α和Notch1之間在原代培養(yǎng)的神經(jīng)

7、元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系（即模擬體內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)）中是否存在相互作用。
　　方法：體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系，應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染方法沉默HIF-1α/Notch1的基因表達(dá)，檢測(cè)沉默后相應(yīng)基因及蛋白水平的表達(dá)變化情況，選擇轉(zhuǎn)染效率高的siRNA用于本次實(shí)驗(yàn)。沉默HIF-1α的基因后應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)Notch1基因及蛋白的表達(dá)水平；相應(yīng)的，沉默Notch1的基因后檢測(cè)HIF-1α的基因及蛋白

8、的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系中，應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染法可以有效地沉默HIF-1α和Notch1的基因表達(dá)。沉默HIF-1α的基因表達(dá)會(huì)降低Notch1基因及蛋白的表達(dá)水平，相應(yīng)的沉默Notch1的基因表達(dá)降低HIF-1α基因及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系（模擬體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)）中，HIF-1α和Notch1之間存在相互作用的關(guān)系。
　　第二部分：HIF-1α和Not

9、ch1在AD細(xì)胞模型中的關(guān)系及作用
　　目的：研究在AD的體外細(xì)胞模型中，HIF-1α和Notch1之間是否存在相互作用。方法：應(yīng)用 ADDLs干預(yù)原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的混合體系從而建立AD的體外細(xì)胞模型，分別干預(yù)4小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，并將細(xì)胞分為對(duì)照組，對(duì)照+ADDLs組，電穿孔轉(zhuǎn)染組，電穿孔轉(zhuǎn)染組+ADDLs組，觀察不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)不同組別的細(xì)胞抑制其HIF-1α和Notch1的基因表達(dá)后，HIF-1α和No

10、tch1的表達(dá)水平的變化情況，觀察兩者之間是否存在關(guān)系。檢測(cè)4小時(shí)，24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)不同組別的細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、與空白對(duì)照組的細(xì)胞相比，應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1的siRNA的細(xì)胞中HIF-1α/Notch1的表達(dá)明顯下降；2、空白對(duì)照組的細(xì)胞在應(yīng)用ADDLs處理后與未處理組的細(xì)胞相比，HIF-1α/Notch1的表達(dá)水平明顯升高，且這種增高的趨勢(shì)隨著時(shí)間的延

11、長(zhǎng)（4小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)）也逐漸增高；3、應(yīng)用ADDLs干預(yù)且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA的細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞相比，HIF-1α/Notch1的表達(dá)明顯升高，且這種增高的趨勢(shì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（4小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)）也逐漸增高；4、HIF-1α/Notch1 siRNA+ADDLs組與空白對(duì)照+ADDLs組相比，HIF-1α/Notch1的表達(dá)是呈降低的趨勢(shì)，也就是說ADDLs誘導(dǎo)的HIF-1α和Notc

12、h1的表達(dá)增高在空白對(duì)照組更明顯；5、應(yīng)用ADDLs干預(yù)4小時(shí)之后，空白對(duì)照組的caspase-3的表達(dá)明顯升高，但增高的程度與應(yīng)用 ADDLs干預(yù)24小時(shí)相比無明顯區(qū)別；6、應(yīng)用 ADDLs干預(yù)4小時(shí)且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA組的細(xì)胞與僅用ADDLs干預(yù)4小時(shí)的細(xì)胞相比，caspase-3的表達(dá)明顯降低，但是ADDLs干預(yù)24小時(shí)后這種趨勢(shì)不明顯，兩組細(xì)胞（ADDLs干預(yù)且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA的

13、細(xì)胞組，僅用ADDLs干預(yù)的細(xì)胞組）中caspase-3的表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論：在ADDLs干預(yù)的AD體外細(xì)胞模型中HIF-1α和Notch1的表達(dá)變化一致，呈正相關(guān)的關(guān)系，且兩者對(duì)ADDLs誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡有影響。
　　第三部分：HIF-1α和Notch1在AD動(dòng)物模型中的關(guān)系
　　目的：研究在APPSWE轉(zhuǎn)基因的AD動(dòng)物模型中，HIF-1α和Notch1的關(guān)系。
　　方法：擴(kuò)增AD模型鼠的群組，建立AD

14、模型鼠的缺氧模型，檢測(cè)不同組別（野生型正常氧組，野生型缺氧組，APPSWE正常氧組，APPSWE缺氧組）的HIF-1α和Notch1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、APPSWE正常氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達(dá)較野生型正常氧組有增高的趨勢(shì)；2、野生型缺氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達(dá)較野生型正常氧組明顯增高；3、APPSWE缺氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達(dá)較APPSWE正常氧組增高，但增高