腫瘤基因工程納米乳劑疫苗的藥效學(xué)研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命和健康。惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法-手術(shù)、放療和化療，治療效果并不理想。隨著免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤疫苗的研制與應(yīng)用已成為治療腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的有力手段。但由于存在缺乏特異性腫瘤抗原和有效的抗原提呈，以及MHC限制性、腫瘤異質(zhì)性、疫苗生物利用度差等問(wèn)題，使得現(xiàn)有疫苗的免疫效果不盡人意。黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen，MAGE)是首先被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤特異性抗原，MAGE-1是MAGE家

2、族的重要成員之一，廣泛表達(dá)于多種組織的腫瘤，而在除睪丸和胎盤外的正常組織中均不表達(dá)，是腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子。目前，基于MAGE-1的腫瘤疫苗能誘導(dǎo)MAGE-1特異性CTL的產(chǎn)生，在腫瘤免疫治療方面倍受重視。熱休克蛋白(HeatShockProtein，HSP)具有分子伴侶作用，參與腫瘤抗原的加工遞呈，在誘導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；最近研究表明，制備結(jié)核桿菌HSP70與目的抗原融合蛋白是提高疫苗效能的有效方法。超抗原SEA可

3、有效激活CD4+T細(xì)胞，協(xié)同加強(qiáng)腫瘤抗原的免疫效果。納米載藥系統(tǒng)是近年來(lái)蓬勃發(fā)展起來(lái)的全新的藥物載體，可有效提高所載藥物，特別是蛋白質(zhì)藥物的生物利用度，與傳統(tǒng)載藥系統(tǒng)相比有很多優(yōu)點(diǎn)。 本研究首先以腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70的融合蛋白為基礎(chǔ)，與超抗原葡萄球菌腸毒素A(SEA)按摩爾比100∶1制成復(fù)合抗原(MHS)；再以納米乳劑為藥物載體包裹MHS，制備出油包水型(W/O)納米乳劑疫苗NE(MHS)，著重對(duì)其

4、進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，為新型廣譜腫瘤基因工程納米疫苗臨床前研究奠定基礎(chǔ)。 1.納米乳劑疫苗的劑量與抗腫瘤效應(yīng)間的量效關(guān)系目的：觀察NE(MHS)與荷B16-MAGE-1腫瘤C57BL/6小鼠腫瘤抑制率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，確定腫瘤抑制率分別為30％和50％的有效劑量和半數(shù)有效量(ED50)，并明確高劑量給藥后小鼠的毒性反應(yīng)。方法：磁力超聲法制備包裹復(fù)合抗原疫苗(融合蛋白MAGE-1/HSP70與超抗原SEA按摩爾比100∶1混合)

5、的油包水型納米乳劑NE(MHS)，并評(píng)價(jià)其粒徑、包裹率及穩(wěn)定性；將NE(MHS)腹腔注入荷B16-MAGE-1腫瘤C57BL/6小鼠體內(nèi)，設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，以明確NE(MHS)劑量與腫瘤抑制率間的關(guān)系，求得抑瘤率分別為30％和50％的有效劑量和半數(shù)有效量(ED50)；觀察高劑量治療組小鼠的一般毒性反應(yīng)，檢查血常規(guī)、肝、腎功，并剖檢動(dòng)物，計(jì)算臟器指數(shù)，重要臟器行病理學(xué)觀察。結(jié)果：①成功制備出粒徑為20±5nm的納米乳劑，其藥物包裹率

6、為87％，于4℃放置6個(gè)月后或3000rpm10分鐘離心后無(wú)分層，證明其穩(wěn)定性良好；②中、高劑量組的平均抑瘤率均大于30％，且和陰性對(duì)照組有顯著性差異，三組劑量的對(duì)數(shù)值和腫瘤抑制率呈線性關(guān)系且具有劑量依賴性：③與PBS對(duì)照組相比，高劑量治療組小鼠未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論：該腫瘤基因工程納米乳劑疫苗具有良好的理化性質(zhì)，能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，并使用安全，是一種很有希望的新型抗腫瘤疫苗。 2.納米乳劑疫苗的抗腫瘤免疫學(xué)效應(yīng)研究目的：評(píng)價(jià)

7、NE(MHS)的抗腫瘤免疫學(xué)特性。方法：以疫苗免疫動(dòng)物，IFN-γELISPOT和LDH殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗激活機(jī)體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，ELISA法檢測(cè)體液免疫反應(yīng)；腫瘤治療、攻擊實(shí)驗(yàn)以及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和切除后復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米乳劑疫苗的抗腫瘤效應(yīng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟中CD4+、CD8+T細(xì)胞情況；RT-PCR檢測(cè)腫瘤局部組織IL-2，IFN-γ和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果：與其它組相比，NE(MHS)組小鼠脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量明

8、顯增多(P＜0.05)，CTL對(duì)B16-MAGE-1的特異性殺傷作用明顯增強(qiáng)，MAGE-1抗體水平較NE(MH)、MH、NE(-)和PBS組明顯增高(P＜0.05)；在腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中，NE(MHS)組B16-MAGE-1腫瘤體積明顯小于其它組，荷瘤小鼠生存期顯著大于其它組(P＜0.01)；在腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)中，NE(MHS)組B16-MAGE-1腫瘤成瘤時(shí)間長(zhǎng)、成瘤率低；在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤切除后復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)中，與其它組小鼠相比，NE(MH

9、S)免疫后小鼠B16-MAGE-1肺臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(P＜0.01)，腫瘤切除后復(fù)發(fā)時(shí)間延遲，復(fù)發(fā)率明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NE(MHS)免疫后小鼠脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞增多，并以CD8+T細(xì)胞增多為主；NE(MHS)免疫后的小鼠腫瘤局部組織經(jīng)RT-PCR檢測(cè)有明確IL-2和TNF-α的表達(dá)。結(jié)論：NE(MHS)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的MAGE-1特異性的細(xì)胞免疫和較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，對(duì)表達(dá)MAGE-1的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作

10、用，對(duì)荷瘤小鼠有很好的治療作用，能有效預(yù)防腫瘤攻擊、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤切除后復(fù)發(fā)。 3.納米乳劑疫苗經(jīng)不同途徑免疫的抗腫瘤免疫學(xué)效應(yīng)研究目的：評(píng)價(jià)NE(MHS)經(jīng)不同途徑免疫小鼠后的抗腫瘤免疫學(xué)特性，探索腫瘤納米乳劑疫苗全新、有效的給藥途徑。方法：小鼠經(jīng)口服(p.o.)、靜脈(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔(i.p.)4種途徑以NE(MHS)免疫，IFN-γELISPOT和LDH殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗激活機(jī)體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的情況；

11、腫瘤治療、攻擊實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果：治療實(shí)驗(yàn)中，B16-MAGE1接種后第28天，與注射免疫的其他3組相比，口服組小鼠腫瘤體積較大(P＜0.05)；除此，IFN-γELISPOT、LDH殺傷實(shí)驗(yàn)和腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)，經(jīng)4組小鼠組間比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：納米乳劑疫苗NE(MHS)經(jīng)不同途徑給藥后免疫效果相近，NE(MHS)適用于多種途徑給藥，是一種使用方便的腫瘤基因工程納米疫苗。 綜上所述，本研究成功制備出粒徑

12、為20±5nm的W/O型納米乳劑疫苗NE(MHS)，其穩(wěn)定性良好，藥物包裹率較高；NE(MHS)能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，與荷B16-MAGE-1小鼠腫瘤抑制率間具有很好的量效關(guān)系；NE(MHS)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的MAGE-1特異性CTL，對(duì)表達(dá)MAGE-1的腫瘤具有良好的治療和預(yù)防作用；以不同的方式免疫小鼠后，NE(MHS)的短期抗腫瘤免疫學(xué)特性相近。本研究為研制高效、生物利用度高、使用安全、方便的腫瘤疫苗開(kāi)辟了新途徑，為本疫苗的臨床前研