支原體的藥效學(xué)研究.pdf

1、脲原體屬(Ureaplasmaspp．)和肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)是最常見的人類致病支原體。脲原體屬是非淋菌性尿道炎(NGU)的第一位病原體，占NGU病原體的60％以上；此外還可以引起子宮內(nèi)膜炎、絨毛膜羊膜炎、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、低體重新生兒及新生兒肺炎、腦膜炎、敗血癥等。肺炎支原體是引起呼吸道感染的主要病原體，研究顯示肺炎支原體占社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquiredpneumoniae，CAP

2、)病原體的40％或以上，兒童中18％的支原體肺炎需要入院治療。歐洲每隔5-7年出現(xiàn)1次肺炎支原體肺炎大規(guī)模流行，持續(xù)6-8月，流行地區(qū)感染率約為14％-18％。 分離培養(yǎng)是診斷支原體感染的金標(biāo)準(zhǔn)。支原體的分離培養(yǎng)及藥敏測定對于了解和監(jiān)測本地區(qū)支原體耐藥性變遷、進行新抗菌藥物藥效學(xué)評價也具有重要意義。支原體體外藥物敏感性試驗方法有多種，主要包括瓊脂稀釋法、微量稀釋法等。目前仍沒有被普遍接受的支原體藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)方法，結(jié)果判定尚無國際

3、統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。更多學(xué)者傾向于采用微量稀釋法進行支原體藥物敏感性測定。國內(nèi)目前僅有個別單位開展支原體的分離培養(yǎng)及藥敏測定工作，國際上開展此方面工作的單位也不多。 臨床用于治療支原體感染的抗菌藥物主要包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類。隨著抗菌藥物的廣泛使用，支原體對上述常用抗菌藥物的敏感性下降。脲原體屬對紅霉素及四環(huán)素耐藥的報道較多，近年來也出現(xiàn)了對氟喹諾酮類耐藥的菌株，這給臨床治療帶來相當(dāng)?shù)睦щy。國外學(xué)者對脲原體耐氟喹諾酮類藥物的

4、機制進行了一些研究，國內(nèi)類似的報道不多。肺炎支原體耐藥性亦不斷增加，日本學(xué)者報道已出現(xiàn)耐紅霉素肺炎支原體，我國北京地區(qū)也有報道。 基于上述情況確立本課題，旨在建立脲原體屬和肺炎支原體分離培養(yǎng)尤其是固體分離培養(yǎng)方法，并從臨床標(biāo)本中分離一定數(shù)量的支原體，建立支原體菌種保存庫。采用改良的微量稀釋法測定脲原體和肺炎支原體的藥物敏感性，了解當(dāng)前本地區(qū)常見人類致病支原體對常用抗菌藥物的敏感性。對敏感性下降的病原體進行耐藥機制的初步研究。

5、 第一部分脲原體屬的分離培養(yǎng)及藥敏測定 建立了脲原體屬固體和液體分離培養(yǎng)方法，在固體培養(yǎng)基上通過顯微鏡觀察到典型菌落，結(jié)合液體培養(yǎng)基的生化變色反應(yīng)，較為準(zhǔn)確、快速地鑒定脲原體屬。采用上述分離培養(yǎng)方法在2004．2．-2006．3．共分離純化脲原體屬120株，其中良好傳代者72株。分離株保存于液氮及一70~C冰箱內(nèi)。 建立了改良的支原體微量稀釋法藥敏試驗方法，測試結(jié)果可靠，與文獻報道一致。采用所建立的微量稀釋法對分離到

6、的52株脲原體進行了藥敏測試。9種抗菌藥物對脲原體屬的體外抗微生物活性見表1。 大環(huán)內(nèi)酯類中，克拉霉素對脲原體屬具有強大的體外抗微生物活性，MICso和MIC90分別為0．125和0．25mg／L，優(yōu)于紅霉素及阿奇霉素。后兩者對脲原體屬也具有良好的體外活性，MIC50分別為2和1mg／L，MIC90分別為4和2mg/L。紅霉素MIC值較標(biāo)準(zhǔn)株升高≥4倍(MIC>_4mg/L)者共有8株，占測試菌株的15．4％(8／52)。

7、 四環(huán)素類中，多西環(huán)素及米諾環(huán)素對脲原體屬具有強大的體外抗微生物活性，其MICso分別為0．125及0．06mg/L，略優(yōu)于四環(huán)素。四環(huán)素MIC值較標(biāo)準(zhǔn)株升高≥4倍(MIC&0．5mg／L)者共有17株，占測試菌株的32．7％(17／52)。 氟喹諾酮類中，左氧氟沙星及加替沙星對脲原體屬具有良好抗微生物活性，MICso均為0．5mg/L，MIC90分別為4和2mg/L；兩者抗微生物活性優(yōu)于環(huán)丙沙星。22株脲原體屬的環(huán)丙沙星MI

8、C值較標(biāo)準(zhǔn)株升高≥4倍(MIC>_4m∥L)，占測試菌株42．3％(22／52)。此22株脲原體同時對新氟喹諾酮類左氧氟沙星和加替沙星敏感性下降。 表1．9種抗菌藥物對52株脲原體屬的體外抗微生物活性(MIC，raga,) 抗菌藥物MIC范圍MICsoMICgo標(biāo)準(zhǔn)株MIC紅霉素0．06-8241克拉霉素0．06-0．25O．1250．25O．125阿奇霉素0．125-8I2I四環(huán)素0．06-40．251O．125多西環(huán)

9、素_<0．06-10．1250．50．125米諾環(huán)素<0．06-40．060．50．06環(huán)丙沙~_0．25-322161左氧氟沙~．0．06-40．540．5加替沙t~．0．06-40．520．5 選擇4株環(huán)丙沙星MIC>_16mg/L的脲原體屬，采用分子生物學(xué)方法對喹諾酮耐藥決定區(qū)(QDRD)的gyrA、gyrB、parc及pare基因進行擴增和序列分析，對喹諾酮類敏感性下降脲原體屬的耐藥機制作了初步研究。結(jié)果顯示，4株脲原體

10、中2株出現(xiàn)QRDR的核苷酸點突變，并導(dǎo)致相應(yīng)編碼的氨基酸改變。其中1株僅有g(shù)yrA一個氨基酸改變：336位核苷酸出現(xiàn)誤義突變，GAC----,GAA導(dǎo)致¨2位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?。?株出現(xiàn)gyrA和parc兩個基因的多個氨基酸改變；gyrA的336位核苷酸出現(xiàn)誤義突變，GAC_→GAA_導(dǎo)致112位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?；parc的248位核苷酸出現(xiàn)誤義突變，TCA→TTA導(dǎo)致83位絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?76及378位核苷酸出現(xiàn)誤義突變

11、，(G)C(T)→(A)C(A)導(dǎo)致125位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；406及408位(G)C(C)→(A)C(T)導(dǎo)致136位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸。環(huán)丙沙星對上述2株脲原體的MIC值均為16mg/L。值得注意的是另2株脲原體對環(huán)丙沙星敏感性明顯下降(MIC=32mg/L)，但檢測QRDR均未發(fā)現(xiàn)基因突變，是否存在QRDR外的DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶IV突變，或存在其它耐藥機制值得進一步研究。 第二部分肺炎支原體的分離培養(yǎng)及藥敏測定

12、 建立了肺炎支原體固體和液體分離培養(yǎng)方法，對分離到的臨床株采用PCR方法進行鑒定。對血清學(xué)檢測陽性或孵育3天后培養(yǎng)液肺炎支原體PCR檢測陽性者進行盲傳，提高了培養(yǎng)陽性率。 白2005．11．-2006．3．共采集兒科病房經(jīng)鼻咽部吸取深部痰液585份，共分離到肺炎支原體19株。分離陽性率為3．2％。培養(yǎng)陽性患者年齡2歲-10歲。 采用微量稀釋法測定了12種抗菌藥物對肺炎支原體的體外抗微生物活性，結(jié)果見表2。沒有出現(xiàn)對上

13、述抗菌藥物敏感性下降的肺炎支原體臨床分離株。 大環(huán)內(nèi)酯類中，紅霉素、克拉霉素及阿奇霉素對肺炎支原體均具有良好的體外抗微生物活性，最低抑菌濃度(MIC)范圍為0．06-0．5mg/L，MICso為O．125-0．25mg/L，MIC90為0．25-0．5mg/L。 四環(huán)素類對肺炎支原體均具有良好的體外活性，四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素的MIC50均為0．015mg／L，MIC90為0．03-0．125mg/L。

14、 5種氟喹諾酮類中，莫西沙星、吉米沙星及加替沙星對肺炎支原體具有強大的體外抗微生物活性，MIC90為0．06-0．125mg/L，優(yōu)于環(huán)丙沙星及左氧氟沙星(MIC90均為0．5mg/L)；但其MIC值略高于四環(huán)素類。 表2．12種抗菌藥物對12株肺炎支原體的體外抗微生物活性(MIC，m嘰) 抗菌藥物MIC范圍MICs0MICgo標(biāo)準(zhǔn)株MIC紅霉素0．06-0．50．250．50．25克拉霉素0．06-0．50．250

15、．50．25阿奇霉素0．06-0．5O．1250．25O．125四環(huán)素0．015-0．250．0150．030．03多西環(huán)素0．015-0．1250．0150．060．015米諾環(huán)素0．015-0．1250．0150．1250．015替加環(huán)素0．015-0．1250．0150．060．015環(huán)丙沙星0．06-10．1250．50．125左氧氟沙星0．06-0．5O．1250．5O．125加替沙星0．015-0．250．06O．1250．