GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康和生命，如何治療惡性腫瘤是人類(lèi)醫(yī)學(xué)所面臨的的重大難題。腫瘤免疫治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后被逐漸認(rèn)可的一種新興治療方法，然而腫瘤細(xì)胞躲避免疫細(xì)胞殺傷從而生長(zhǎng)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移、侵襲即腫瘤免疫逃逸是腫瘤免疫治療的最大障礙。具有抑制性功能的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）在腫瘤免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色[1]。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩技術(shù)篩選出可與免疫細(xì)胞表面結(jié)合的一系列腫瘤源性分子，其中TGF-β超家族成員GD

2、F-15最為引起我們的關(guān)注。有研究顯示GDF-15在血清中的含量與腫瘤的分期相關(guān)[2]，且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞中，Treg比例明顯升高[3]，我們課題組在前期實(shí)驗(yàn)中在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)，外周 Tregs數(shù)量與血清中GDF-15的水平隨腫瘤的惡性程度升高而增加，且首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清GDF-15水平與Treg比例兩者呈現(xiàn)正相關(guān)，同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道GDF-15能夠促Foxp3表達(dá)量上調(diào)[4]，而Foxp3[5

3、]作為T(mén)reg特異的分子標(biāo)志，在Treg的發(fā)育與功能中起著至關(guān)重要的作用。因此我們推測(cè)，GDF-15在iTreg的誘導(dǎo)分化中可能具有重要作用。我們擬通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等實(shí)驗(yàn)方法闡明GDF-15作用于na?ve CD4+T細(xì)胞使其向iTreg分化的誘導(dǎo)作用，探索GDF-15在誘導(dǎo)iTreg分化中的分子機(jī)制。
　　方法：本課題計(jì)劃從以下三方面進(jìn)行研究：1、系統(tǒng)研究GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞fox

4、p3表達(dá)量升高。利用免疫磁珠法從人外周血中分離得到na?ve CD4+T細(xì)胞，加入 GDF-15刺激，利用 Real-time PCR及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí) GDF-15在mRNA水平上和蛋白水平上均能上調(diào)Foxp3，同時(shí)研究GDF-15對(duì)于上調(diào)foxp3有無(wú)時(shí)象特點(diǎn)；2、進(jìn)一步確認(rèn)GDF-15誘導(dǎo)后的na?ve CD4+T細(xì)胞能否向iTreg方向分化，即具有iTreg的表型和功能，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)

5、驗(yàn)方法分析了GDF-15刺激后的na?ve CD4+T細(xì)胞iTreg相關(guān)抑制性膜分子的表達(dá)水平，以及相關(guān)抑制性細(xì)胞因子的分泌水平。3、在進(jìn)一步的GDF-15作用機(jī)制研究中，我們通過(guò)激光共聚焦、實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析并闡明GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞向iTregs分化的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們得到了下列結(jié)果：1、GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve

6、CD4+T細(xì)胞foxp3表達(dá)量上調(diào)，在第一天就能觀(guān)察到foxp3表達(dá)上調(diào)，在第三天出現(xiàn)顯著變化。且在na?ve CD4+T細(xì)胞活化后兩天內(nèi)加入GDF-15刺激時(shí)，foxp3表達(dá)也可以上調(diào)，在活化兩天以后再加入GDF-15刺激后，則無(wú)法上調(diào)foxp3表達(dá)。GDF-15刺激na?ve CD4+T細(xì)胞活化后不同時(shí)間點(diǎn)撤去 GDF-15刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在撤去 GDF-15刺激2天后，F(xiàn)oxp3上調(diào)比例均有所下降。2、加入 GDF-15刺激后，na

7、?ve CD4+T細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平上均高表達(dá) iTreg表面膜分子 CD103、CD25、GITR等。同時(shí)，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等在GDF-15刺激后也明顯表達(dá)上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后na?ve CD4+T細(xì)胞具有了iTreg樣表型。3、根據(jù)文獻(xiàn)提示[6]，我們推測(cè)GDF-15可能通過(guò)結(jié)合TGF-βRII發(fā)揮作用。因此我們用TGF-βRII中和抗體對(duì)細(xì)胞表面的受體進(jìn)行封閉，進(jìn)而檢

8、測(cè)GDF-15是否依舊能夠上調(diào)Foxp3。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，foxp3表達(dá)水平較未加受體抗體封閉組高，且激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Real-time PCR相符，提示我們GDF-15通過(guò)TGF-βRII發(fā)揮作用。我們利用了Smad通路抑制劑SB431542以及ERK通路抑制劑PD98059對(duì)Smad通路和ERK通路分別進(jìn)行阻斷，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，阻斷Smad通路GDF-15刺激后foxp3表達(dá)量明顯弱于GDF-15刺激組，而阻斷E

9、RK通路，GDF-15能夠更加明顯上調(diào)foxp3，Western blot結(jié)果也與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果相一致。結(jié)果說(shuō)明，GDF-15可以通過(guò)活化Smad通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，加入中和抗體封閉TGF-βRII后，Smad通路活化被抑制。對(duì)于ERK通路來(lái)說(shuō)，GDF-15可以抑制ERK通路的活化，TGF-β受體封閉后GDF-15對(duì)ERK通路抑制狀態(tài)也發(fā)生了部分逆轉(zhuǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果提示我們 GDF-15上調(diào) Foxp3表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于

10、Foxp3啟動(dòng)子的-1657bp至-1210bp處，結(jié)合生物信息學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，我們推測(cè)GDF-15可能通過(guò)NFAT和CREB轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)上調(diào)；促進(jìn)其向iTreg方向分化，同時(shí)能夠表達(dá) iTreg相關(guān)抑制性膜分子和分泌抑制性細(xì)胞因子；間接證實(shí)了GDF-15通過(guò)與TGF-βRII結(jié)合，激活Smad通路同時(shí)抑制ERK通路從而誘導(dǎo)iTreg分化。GDF