軸突生長抑制因子重組疫苗對(duì)阿爾茨海默癥APP-PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠的預(yù)防.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease；AD)又名老年癡呆癥是引發(fā)癡呆的最常見疾病。表現(xiàn)為記憶、智力、判斷能力、情感障礙和行為失常甚至發(fā)生意識(shí)模糊等,其顯著的病理學(xué)特征是腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、和神經(jīng)元和突觸丟失。隨著人口老齡化的加重阿爾茨海默癥越來越受到人們的重視。其發(fā)病機(jī)制尚為數(shù)個(gè)假說,其中淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein；APP)水解產(chǎn)物Amyloidβ(Aβ)蛋白為阿爾茨海

2、默癥發(fā)病首要原因的假說占主導(dǎo)地位。目前的藥物治療只能減輕患者癥狀并不能對(duì)AD起到根本性治療作用。免疫治療主要集中針對(duì)Aβ蛋白,雖然腦膜腦炎副作用的產(chǎn)生成為了Aβ疫苗進(jìn)入臨床的阻礙,但疫苗可降低病人腦內(nèi)老年斑改善病人學(xué)習(xí)記憶異常的事實(shí)是人們看到了免疫治療治愈AD疾病的希望。軸突生長抑制蛋白(neurite outgrowth inhibitors；NOIs)一類以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生為主要功能的蛋白。Tenascin-R(TN-

3、R)、Tenascin-C(TN-C)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘相關(guān)糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein；OMGP)、Nogo、受體樣蛋白酪氨酸磷酸酶β(Thereceptor-type protein tyrosine phosphataseβ；RPTPβ)均為軸突生長抑制因子成員。NOIs主要聚集于中樞神經(jīng)元的

4、郎飛氏結(jié)處,而研究表明在AD疾病中占有重要地位的APP蛋白亦聚集表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的郎飛氏結(jié)處,郎飛氏結(jié)是有髓神經(jīng)纖維的重要功能位置,除上述兩種蛋白外,大量在神經(jīng)細(xì)胞功能中占有重要地位的離子通道亦聚集于此處。我們推測NOIs蛋白可在郎飛氏結(jié)處通過與APP得相互作用,影響其水解過程即Aβ蛋白的產(chǎn)生從而影響AD疾病的發(fā)生發(fā)展。此外,由單個(gè)NOI蛋白抗體或數(shù)個(gè)NOIs蛋白免疫小鼠可促進(jìn)體內(nèi)外中樞神經(jīng)的再生。我們推測抑制NOIs的功能亦能改善A

5、D疾病中神經(jīng)元的退行性變達(dá)到預(yù)防或治療AD的目的。
　　 構(gòu)建由數(shù)個(gè)NOIs蛋白片段重組的DNA疫苗,免疫AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型來檢驗(yàn)抑制NOIs對(duì)AD的預(yù)防或治療作用。我們構(gòu)建了三個(gè)由NOIs數(shù)個(gè)蛋白抗原片段不同組合的重組疫苗,通過DNA疫苗肌肉免疫的方式檢測其在體內(nèi)抗體的產(chǎn)生。行為學(xué)檢測了疫苗對(duì)AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶改善情況,并檢測了疫苗對(duì)模型小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑沉積的改變。我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)疫苗PcDNA-V2可有效減少模型小鼠腦

6、內(nèi)老年斑的沉積,但同時(shí)看到單純DNA疫苗肌肉免疫小鼠雖能產(chǎn)生抗體但抗體效價(jià)不高。為了提高抗體確保疫苗實(shí)驗(yàn)有效,我們包被了與PcDNA-V2含有相同抗原片段的痘病毒疫苗(vaccinia virus vaccine2；VV-V2),通過肌肉注射DNA疫苗初免痘苗病毒加強(qiáng)的的方式免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠。通過對(duì)小鼠血清中抗體檢測,我們發(fā)現(xiàn)DNA疫苗與痘苗病毒疫苗聯(lián)合免疫的方式可產(chǎn)生有效且較高的抗體,同時(shí)并未在免疫小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)炎癥副反

7、應(yīng)。水迷宮、開放曠場等行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)疫苗能夠有效的抑制轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙及情緒異常,隨后用三種方式檢測了AD發(fā)病中占主流假說的Aβ蛋白不同的表達(dá)形式,發(fā)現(xiàn)雖然疫苗并未改變Aβ蛋白總量,卻顯著降低了Aβ蛋白兩種主要構(gòu)成成分Aβ42和Aβ40之間的比值,在Aβ蛋白總量不變的情況下,Aβ42和Aβ40的比值升高被認(rèn)為是AD的危險(xiǎn)發(fā)病因素之一；此外發(fā)現(xiàn)疫苗能夠有效降低免疫小鼠海馬皮質(zhì)不溶性Aβ蛋白表達(dá)形式老年斑的產(chǎn)生；可溶性的Aβ

8、蛋白寡聚體被認(rèn)為是Aβ蛋白所有表達(dá)形式中最早對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性的,我們發(fā)現(xiàn)疫苗也可有效抑制模型小鼠腦內(nèi)可溶性寡聚體的異常升高。隨后對(duì)海馬皮質(zhì)的電鏡檢測中發(fā)現(xiàn)疫苗亦明顯抑制了AD模型小鼠的神經(jīng)元退行性改變。
　　 以上結(jié)果均證實(shí)在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中NOIs重組疫苗能有效改善AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠的行為學(xué)異常,抑制其腦內(nèi)神經(jīng)元退行性變,并降低模型小鼠腦內(nèi)Aβ蛋白的表達(dá)。雖然疫苗的具體作用位點(diǎn)及機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí),但推測其可能為通過與APP相互