阿爾茨海默病重組Aβ1-15表位嵌合疫苗研究.pdf

1、阿爾茨海默病是老年癡呆的一種，作為一種神經(jīng)退行性疾病，它不僅使患者的學習和認知能力急劇減弱，同時也給罹患此病的病人及家庭帶來的極大的痛苦和困擾。阿爾茨海默病的發(fā)病率正以驚人的速度不斷增長，全球患病者人數(shù)日益增多，使得全球各個國家不得不重視該病發(fā)生發(fā)展所帶來的危害和影響，因此針對該病進行有效的預防和治療已成為當下科學研究者刻不容緩的責任。
　　依據(jù)目前認可度較高的淀粉樣假說理論，APP蛋白的異常降解導致患者大腦中積累大量可溶性Aβ4

2、2或Aβ40肽，進一步的聚集導致了大腦內(nèi)淀粉樣斑塊的形成。同時毒性Aβ42肽的存在促進Tau蛋白的磷酸化以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的壞死等，導致一系列的病理蛋白積累及病理反應，最終促成了阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展。因此靶向Aβ肽的治療方法——主動免疫和被動免疫，成為當下免疫治療阿爾茨海默病的主流方案。
　　通過對AN-1792臨床試驗失敗的結(jié)果進行探究分析知，Aβ1-42肽的T細胞表位引發(fā)了自身毒性T免疫細胞反應，因此選取適當?shù)募毎砦粯?gòu)建新型

3、疫苗用以進行阿爾茨海默病的防治，且能夠特異性清除最具毒性的Aβ寡聚體，是新的免疫治療策略。
　　正是基于這種設(shè)計理念，先前本課題組選取了Aβ1-42的B淋巴細胞表位Aβ1-15進行疫苗抗原的構(gòu)建工作。采用Aβ1-15多拷貝串聯(lián)連接輔助性T細胞表位載體分子的方式構(gòu)建了一系列的嵌合抗原。隨后完成嵌合抗原的原核表達純化，并對所構(gòu)建嵌合抗原完成了初步的免疫原性探討，證實嵌合抗原疫苗在普通Balb/c和APP小鼠身上具有良好的免疫原性，誘導

4、產(chǎn)生了具有Aβ42寡聚體特異結(jié)合的治療性抗體，且能清除腦內(nèi)的Aβ沉積，具有良好的疫苗效果。
　　本研究選取了兩種最具代表性且初期實驗效果較優(yōu)的兩種表位嵌合抗原——6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C，進行深層次的免疫原性和疫苗效應評價。首先對原核表達純化的嵌合抗原進行了免疫原性的研究。通過6Aβ15-T與不同佐劑聯(lián)合免疫普通Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，測定免疫后小鼠的抗體水平以及細胞免疫實驗結(jié)果，篩選獲得最優(yōu)抗原佐劑配

5、對方案。實驗結(jié)果顯示，嵌合抗原聯(lián)合A1佐劑免疫實驗小鼠后，小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生較強的針對Aβ42的特異性抗體，免疫反應偏向于Th2型，細胞免疫結(jié)果顯示主要產(chǎn)生針對輔助性T細胞表位特異性的T淋巴細胞免疫反應，無Aβ42特異性的T淋巴細胞免疫反應。且以上免疫反應相較于其他佐劑聯(lián)合免疫組，產(chǎn)生更明顯的Th2型抗體反應，提示傳統(tǒng)的人用A1佐劑作為AD疫苗的佐劑是合適并有效的。而后利用A1佐劑同時聯(lián)合兩種表位嵌合抗原在3×Tg AD模型小鼠身上進行抗原

6、的免疫原性研究。結(jié)果顯示免疫后的AD模型小鼠體內(nèi)也產(chǎn)生了較高水平的針對Aβ42肽的抗體，且免疫反應偏向于Th2型。淋巴細胞增殖實驗結(jié)果也顯示，AD模型小鼠沒有產(chǎn)生針對Aβ42肽的自身毒性T淋巴細胞反應。AD模型小鼠免疫實驗進一步證實，嵌合抗原能夠克服免疫耐受，免疫后誘使機體產(chǎn)生較強的Th2型免疫反應，提示該疫苗具有較好的應用前景。
　　最后，重組嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C聯(lián)合A1佐劑在3×Tg AD模型小鼠身上

7、進行免疫預防和免疫治療實驗研究，以此評價疫苗效應。這兩項實驗分別在3M小鼠和12M小鼠身上進行。實驗結(jié)果顯示，3M和12M小鼠的免疫治療過程中，兩種嵌合抗原的注射均能誘使機體產(chǎn)生高水平的抗體，且能在體內(nèi)維持較長時間。免疫反應偏向于Th2型，無Aβ42特異性T淋巴細胞反應。對水迷宮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，兩種嵌合抗原免疫組小鼠的行為認知和記憶學習能力較未治療小鼠有較明顯的提升。同時對小鼠腦組織進行研究發(fā)現(xiàn)，治療后可溶性Aβ寡聚體減少，由毒

8、性Aβ誘發(fā)的一些病理指示性蛋白也發(fā)生了某些良性變化。DynaminⅠ隨著病程發(fā)生，表達量會降低，而治療后小鼠與對照相比，蛋白表達量明顯增高。而受毒性Aβ影響而發(fā)生降解的Spectrin蛋白，在治療小鼠中能看到降解減緩的趨勢。提示AD病理特征的減弱，病情好轉(zhuǎn)，與典型病理指標和行為學能力表現(xiàn)相一致。免疫組化實驗結(jié)果更為直觀地顯示出治療后小鼠Aβ斑塊沉積明顯減少，磷酸化Tau蛋白也有緩解的趨勢。盡管免疫治療的12M小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平較3M

9、小鼠產(chǎn)生的抗體弱，但是也能達到較高的抗體水平，能夠產(chǎn)生有效的免疫治療效果。
　　以上實驗結(jié)果表明，兩種重組表位嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C在普通小鼠和AD模型小鼠身上均具有良好的免疫反應，能夠產(chǎn)生Aβ42寡聚體特異結(jié)合的Th2型治療性抗體。且利用這兩種抗原免疫治療AD小鼠后，AD小鼠的病理特征明顯減弱，學習記憶認知能力得到較好的提升，提示這兩種嵌合抗原疫苗具有良好的免疫治療效果，可作為在免疫治療阿爾茨海默病的候選