中藥PN-1及丙戊酸鈉對(duì)APP-PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、中藥PN-1對(duì)APP／PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型認(rèn)知能力的改善及機(jī)制研究
　　 背景：阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。該病發(fā)病年齡多在65歲以后，平均病程約8～10年，臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、理解、判斷推理能力以及社會(huì)適應(yīng)能力、個(gè)人生活能力慢性進(jìn)行性減退，最終發(fā)展為嚴(yán)重癡呆，常因褥瘡、骨折、肺炎、營(yíng)養(yǎng)不良等繼發(fā)軀體疾病或衰竭而死亡。據(jù)預(yù)計(jì)，2050年在全球

2、范圍內(nèi)每85人中將有1人罹患AD。隨著全球人口老齡化程度的加劇，AD患者的日益增加已成為各國(guó)主要的保健和社會(huì)問(wèn)題之一。AD的確切病因尚不清楚。但神經(jīng)病理學(xué)研究結(jié)果提示該疾病與大腦內(nèi)老年斑(senileplaque，SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangle，NFT）形成有關(guān)。可能的機(jī)制包括β淀粉樣肽（amyloidbeta，Aβ）沉積、炎癥損傷、氧化應(yīng)激、自由基損傷等。其中，Aβ級(jí)聯(lián)假說(shuō)被認(rèn)為是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)

3、。該假說(shuō)認(rèn)為Aβ聚集是始動(dòng)因素，Aβ聚集后損傷突觸，激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷突觸傳遞和神經(jīng)元功能，最終導(dǎo)致癡呆。目前，美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的5種治療AD的藥物僅限于乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑和NMDA受體拮抗劑，但均不能根治和逆轉(zhuǎn)病程。因此，探索新的AD治療策略和治療藥物對(duì)于降低AD死亡率和減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)均具有重要的意義。近年來(lái)，隨著學(xué)習(xí)記憶的分子神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究的進(jìn)展，神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于維持正常的認(rèn)知

4、能力具有重要意義。并且，臨床和動(dòng)物模型研究均發(fā)現(xiàn)，AD腦內(nèi)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能存在缺陷。因此，本研究將從突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探討APP/PSI轉(zhuǎn)基因小鼠模型學(xué)習(xí)記憶缺陷的分子生物學(xué)機(jī)制，并以改善突觸功能為目的來(lái)評(píng)估和探討中藥治療AD的療效和機(jī)制。
　　 方法：將5月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型隨機(jī)分為模型組(Vehicle)、安理申治療組(Aricept,2mg/kg)、中藥PN-1低(0.6g/kg)、中(1.2g/kg

5、)、高(2.4g/kg)劑量組，并以同窩陰性的C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組(WT)，每組20只，雌雄各半。給藥組小鼠每天灌胃給藥1次，同時(shí)模型組及正常組小鼠則給予等體積的雙蒸水。給藥前稱量小鼠初始體重、攝食量和飲水量；給藥期間，每?jī)芍苤鹬环Q量體重一次，同時(shí)稱量并計(jì)算平均攝食量和飲水量。給藥3個(gè)月后（8月齡）應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察PN-1對(duì)APP/PSI小鼠自主行為和認(rèn)知功能的改善作用；免疫組織化

6、學(xué)和硫磺素．S染色檢測(cè)腦內(nèi)老年斑含量；應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)可溶性和非可溶性Aβ40和Ap42總量；Westernblotting和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)量；檢測(cè)腦重、腦系數(shù)、血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cr)等指標(biāo)的含量以評(píng)估PN-1對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)和肝腎功能的影響。
　　 結(jié)果：PN-1給藥3個(gè)月能夠顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在曠場(chǎng)中的活動(dòng)量，增加新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的識(shí)別指數(shù)，

7、減少M(fèi)orris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)的潛伏期，并增加空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)和停留時(shí)間。PN-1給藥4個(gè)月能夠顯著減少海馬內(nèi)可溶性Aβl-40和可溶性Aβl-42濃度；減少APP/PS1小鼠腦皮層和海馬內(nèi)老年斑的面積、數(shù)量和致密度。PN-1給藥4個(gè)月能夠增加APP/PS1小鼠腦內(nèi)突觸結(jié)合蛋白(Syt1)、鈣調(diào)蛋白(CaM)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，增加磷酸化鈣調(diào)激酶Ⅱ(p-caMⅡ，Thr286

8、）、磷酸化鈣調(diào)激酶Ⅳ(p-CaMKIV，Thr196+Thr200)和磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB，Ser133)的相對(duì)含量。此外，PN-1給藥3個(gè)月對(duì)APP/PS1小鼠體重、攝食量和飲水量均無(wú)顯著影響；PN-1給藥4個(gè)月對(duì)APP/PS1小鼠腦重、腦系數(shù)和肝腎功能亦無(wú)顯著影響。
　　 結(jié)論：PN-1顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠異常增高的興奮性和異常增多的活動(dòng)量、改善小鼠認(rèn)知功能；減少腦內(nèi)Aβ水平和淀粉樣多肽沉

9、積；增加腦內(nèi)突觸可塑性相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，該藥未見對(duì)小鼠代謝、神經(jīng)系統(tǒng)和肝腎功能有明顯毒性作用。
　　 第二部分、丙戊酸鈉(VPA)對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型認(rèn)知功能的作用及機(jī)制初探
　　 背景：表觀遺傳學(xué)主要研究DNA序列未發(fā)生變化、可遺傳的基因表達(dá)改變。近幾年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾參與了大腦的學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程。表觀遺傳作用通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾等調(diào)控方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的控制。其

10、中，由組蛋白去乙酰化酶(HDACs)介導(dǎo)的組蛋白修飾與學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)系研究較為充分。HDACs是一個(gè)大的去乙酰化酶家族，其成員目前已知有18個(gè)不同的亞型，按蛋白同源性分為4大類：HDACI類（包括HDACI，2,3，8）、HDACⅡA類(包括HDAC4,5，7，9)、HDACⅡB類（包括HDAC6，10）、HDACⅢ類（包括SRIT1～7）和HDACⅣ類(HDAC11)。并且，研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類中的HDAC2在海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性方

11、面起著重要的負(fù)調(diào)控作用。因此，研究和開發(fā)HDAC抑制劑對(duì)于以認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病具有重要的治療意義。
　　 方法：5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠隨機(jī)分為模型組(Vehicle)、丙戊酸鈉(VPA，100mg/kg)組，并以同窩陰性的C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組(WT)，每組20只，雌雄各半。給藥組小鼠每天腹腔注射給藥1次，同時(shí)模型組及正常組小鼠給予等體積的生理鹽水。給藥3個(gè)月后（8月齡）應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

12、和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察VPA對(duì)APP/PS1小鼠自主行為和認(rèn)知功能的改善作用；Westernblotting和免疫組化方法檢測(cè)小鼠海馬H3和H4表達(dá)量及其乙?；健DAC2、突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)量；HDACs總活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HDACs和HDAC2活性。
　　 結(jié)果：VPA給藥3個(gè)月后，APP/PSI轉(zhuǎn)基因小鼠在曠場(chǎng)中的興奮性和自主活動(dòng)量較模型組小鼠顯著減少，Morris水迷宮隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)的潛伏期顯著

13、縮短，并且空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)和滯留時(shí)間明顯增加。VPA給藥4個(gè)月后，小鼠海馬組蛋白H3、H4表達(dá)量與模型組小鼠相比無(wú)顯著變化，但乙酰化組蛋白H3(K9)、H4(K8)水平顯著升高。此外，各組間HDAC2表達(dá)量并無(wú)顯著性差異，但VPA給藥后海馬HDACs和HDAC2的活性顯著降低、小鼠海馬NR2B、CaM表達(dá)量較模型組顯著增加，并且磷酸化CaMn(Tyr286)和磷酸化CREB(Ser133)水平也明顯增加。

14、　　 結(jié)論：1）VPA具有情緒穩(wěn)定功能；2）VPA是一種HDACs抑制劑；3)VPA可能通過(guò)降低HDACs/HDAC2的活性、促進(jìn)組蛋白乙?；揎?、增加突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。
　　 第三部分、成年C57BL／6J小鼠腦HDAC2的表達(dá)分布及細(xì)胞類型定位
　　 背景：組蛋白乙?；ヒ阴；揎検侨旧|(zhì)構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制之一。在組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs）的作用下，組

15、蛋白H3或H4特定位點(diǎn)的賴氨酸殘基發(fā)生乙?；磻?yīng)，使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散、轉(zhuǎn)錄因子更易于與基因啟動(dòng)子區(qū)相互結(jié)合并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。相反，乙?；慕M蛋白在組蛋白去乙?；?HDACs)的作用下發(fā)生脫乙酰化反應(yīng)，誘導(dǎo)染色質(zhì)固縮和基因表達(dá)減少。組蛋白乙?；ヒ阴；揎椩谏窠?jīng)細(xì)胞形成、學(xué)習(xí)和記憶、神經(jīng)退行性疾病等生理和病理過(guò)程中的作用已有較多報(bào)道。并且，作為HDACs亞型之一的HDAC2在神經(jīng)元發(fā)育分化、突觸可塑性、抑郁、肌萎縮性側(cè)索硬化癥

16、(ALS)等生理和病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。但目前有關(guān)HDAC2在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)分布情況報(bào)道較少。
　　 方法：應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)HDAC2在成年C57BL/6J小鼠腦內(nèi)的表達(dá)分布情況；應(yīng)用熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)HDAC2與神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(MAP2)、膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(ChAT)、血清素能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(SERT)、兒茶酚胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(DBH)、谷氨酸能突觸后神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(NRI)、γ-氨基丁酸能

17、突觸后神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(GABAARcα1)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(MOSP)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Iba-1)的共表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果分析表明，HDAC2主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，并在成年C57BL/6J小鼠腦內(nèi)分布較為廣泛，尤以海馬錐體細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、小腦顆粒細(xì)胞層、嗅球內(nèi)叢狀層表達(dá)最為豐富；在丘腦和下丘腦的某些亞區(qū)呈輕、中度表達(dá)；在中腦、基底節(jié)和腦干的某些亞區(qū)表達(dá)較弱。熒光雙標(biāo)實(shí)

18、驗(yàn)顯示，HDAC2與MAP2存在明顯的共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ChAT、SERT、DBH、NR1、GABAARα1陽(yáng)性染色的細(xì)胞內(nèi)均有HDAC2的表達(dá)。在與膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的共定位研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC2與MOSP有明顯的共表達(dá)現(xiàn)象，但在GFAP、Iba-1陽(yáng)性染色的細(xì)胞內(nèi)未見有HDAC2的表達(dá)。
　　 結(jié)論：HDAC2在成年C57BL/6J小鼠腦內(nèi)的分布較為廣泛，主要表達(dá)于神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)