乙腦病毒prME蛋白與鼠免疫球蛋白G Fc段編碼基因的融合構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：本項(xiàng)研究采用巢式-RT-PCR法從BALB/c鼠脾組織獲取免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)G Fc段編碼基因，用限制性內(nèi)切酶從乙腦病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)重組子pJME中獲取prME蛋白編碼基因，分別將二者插入同一真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)不同酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建重組子命名為pJME/IgG Fc，并建立穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的CHO細(xì)胞株，為流行性乙型腦炎(Japane

2、se encephalitis，JE)DNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)等方面研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、細(xì)胞及動物:中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫，生長于37℃，5％CO2及含10％胎牛血清(Fatal calf serum，F(xiàn)CS)的Dulbecco modified eagle medium(D-MEM)高糖培養(yǎng)液中。BALB/c鼠購自

3、中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。 2、質(zhì)粒及菌株:含JEV prME蛋白編碼基因重組質(zhì)粒被命名為pJME，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司，用于JEV prME蛋白與IgG Fc段編碼基因的融合構(gòu)建；大腸桿菌JM109與DH5α購自Takara公司，用于重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化。 3、主要試劑 RNA抽提試劑(Code No.D312)，RT-PCR試劑盒(Code No.DR

4、027A)，DNA片斷純化試劑盒(Code No.DV807)，DNA A尾試劑盒(Code No.D404)，瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(Code No.DV805)，DNA連接試劑盒(Code No.D6023)，質(zhì)粒小劑量提取試劑盒(Code No.DV801A)，限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI以及NotI等均購自Takara公司，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定。脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)購自Invitroge

5、n公司，用于CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染。新霉素類似物(G418)購自GiBCO公司，用于CHO細(xì)胞抗性克隆株的篩選。氨芐青霉素購自Sigma公司，瓊脂糖購自Takara公司，用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和電泳分析：D-MEM高糖培養(yǎng)液，10％FCS，青，鏈霉素均購自?？坡」荆糜贑HO細(xì)胞的培養(yǎng)；山羊抗鼠IgG-Fc購自Santa公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗山羊CD32購自北京中杉公司，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的免疫熒光檢測；蛋白裂解液，上樣緩沖液，PVDF膜，預(yù)染蛋白

6、Marker購自碧云天公司，辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購自北京中杉公司，均用于Western-blot分析。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、JEV prME蛋白與鼠IgG Fc段編碼基因的重組構(gòu)建:從BALB/c鼠脾組織提取總RNA，巢式-RT-PCR方法擴(kuò)增，經(jīng)修飾后形成IgG Fc段編碼基因片段，將其構(gòu)建于測序載體pMD19-T simple EcoRI/NotI酶切位點(diǎn)，采用ABIPRSMTM 310Genetic Analyz

7、er(Pekin-Elmer/Applied)及引物Bca BEST PrimerRV-M對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，并與Genebank公布的IgG Fc CDS區(qū)域序列相比較。 2、pJME/IgG Fc穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株確定:本實(shí)驗(yàn)最佳G418篩選濃度：將常規(guī)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞(1000個/mL)加入24孔板(0.7mL/每孔)孵育，6h后每孔分別加入不同濃度的G418。 3、免疫熒光檢測:

8、6孔組織培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)pJME/IgG Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60％-70％時，4％多聚甲醛固定細(xì)胞1h，0.1％Triton-100打孔10min，10％BSA封閉1h，山羊抗鼠IgG Fc4℃過夜孵育，兔抗山羊CD32 37℃避光孵育1h，50％甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察。 4、western-blot分析:細(xì)胞裂解物經(jīng)8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每種樣品上樣總量30μl，之后轉(zhuǎn)印于PVDF膜過夜，取膜經(jīng)

9、5％脫脂奶粉室溫振蕩孵育2h后，將山羊抗鼠IgG Fc抗體與膜4℃過夜孵育，TBST室溫洗膜3×10min，將膜與連接辣根過氧化酶兔抗山羊IgG在室溫反應(yīng)1h，再次洗膜3×10min，3',3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色檢測pJME/IgGFc編碼的特異性融合蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、pJME/IgG Fc的重組構(gòu)建巢式-RT-PCR法獲得IgG Fc段編碼基因經(jīng)測序分析與發(fā)表的IgG Fc CDS區(qū)域序列相符合

10、。酶切獲取pJME中JEV prME蛋白編碼基因，測序分析與發(fā)表的基因序列相符合。重組子pJME/IgG經(jīng)BamHI/EcoRI酶切釋出的插入子與pJME經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致，又經(jīng)BamH I/NotI酶切釋出的插入子分子量約在2500bps-3000bps之間。DNA測序分析兩個目的基因在真核表達(dá)載體中正常連接。 2、pJME/IgG Fc在CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染G418最適篩選濃度為800mg/L。將轉(zhuǎn)染pJM

11、E/IgG Fc的CHO細(xì)胞加壓篩選(800mg/L G418)7d，培養(yǎng)板中可見小細(xì)胞團(tuán)簇形成，G418濃度減半(400mg/L)維持培養(yǎng)約30d，普通光鏡檢查顯示小細(xì)胞團(tuán)簇逐步增大，細(xì)胞團(tuán)簇之間逐漸融合。 3、pJME/IgG Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的免疫熒光檢測pJME/IgG Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞可見較顯著綠色熒光標(biāo)記，主要分布在胞漿，也可見于胞膜。單純載體轉(zhuǎn)染或未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中未見特異性綠色熒光標(biāo)記，僅見散在的非

12、特異性綠色熒光雜質(zhì)。 4、pJME/IgG Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的免疫印跡分析將pJME/IgG Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞裂解并提取蛋白進(jìn)行Western blot分析，在大于Mr約95×103以上電泳區(qū)域內(nèi)可檢測得到一特異性蛋白帶，而單純載體轉(zhuǎn)染或未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞未見相應(yīng)蛋白帶。 結(jié)論： 1、構(gòu)建的重組子pJME/IgG Fc含有prME和IgG Fc基因。 2、轉(zhuǎn)染了pJME/IgG Fc的CHO細(xì)