血小板Sema4D鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序的鑒定及其調(diào)控Sema4D切割的機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)導(dǎo)向因子Semaphorin4D(Sema4D；CD100)是首先在T淋巴細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)B細(xì)胞分化功能的I型跨膜糖蛋白，進(jìn)一步的研究表明Sema4D通過其受體CD72/Plexin-B1/Plexin-B2參與免疫反應(yīng)、神經(jīng)生長、腫瘤血管新生、血栓形成以及骨生長等。Sema4D可以被金屬蛋白酶17（ADAM17）切割，產(chǎn)生具有生物活性的可溶性蛋白。然而，Sema4D切割和可溶性Sema4D生成的調(diào)控機(jī)制所知甚少。目前認(rèn)為可能有

2、兩種機(jī)制：第一，切割酶的表達(dá)和活性的增強(qiáng)可導(dǎo)致Sema4D的切割；第二，“底物主導(dǎo)”的切割機(jī)制，Sema4D構(gòu)象改變后可以更接近切割酶，導(dǎo)致自身被切割。本論文根據(jù)Sema4D的切割可能是“底物主導(dǎo)”（substrate-oriented）的設(shè)想，系統(tǒng)分析了Sema4D氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Sema4D的胞內(nèi)段近膜區(qū)含有一段18個氨基酸組成的序列（Arg762-Lys779），這段序列具有保守的極性氨基酸殘基，并且可以形成兩親性α螺旋

3、，這是鈣調(diào)蛋白結(jié)合的特征性結(jié)構(gòu)。利用免疫共沉淀技術(shù)，我們證明在靜息血小板中Sema4D分子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，血小板活化后Sema4D-鈣調(diào)蛋白復(fù)合體解離,提示鈣調(diào)蛋白參與Sema4D切割調(diào)控。
　　為了探究Sema4D是否通過這段18個氨基酸組成的基序與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，我們合成了 Sema4D鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序的多肽，命名為Sema4D鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（Calmodulin-binding peptide of Sema4D, CBPS）

4、，以這段多肽作為一種工具來進(jìn)一步研究 Sema4D-鈣調(diào)蛋白結(jié)合的分子機(jī)制，以及阻斷結(jié)合所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。利用蛋白標(biāo)記、結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明CBPS可與天然和重組Sema4D結(jié)合，其解離常數(shù)為165±40 nM，這與血小板表面其他受體與鈣調(diào)蛋白的解離常數(shù)類似。將CBPS多肽作為工具來研究Sema4D切割，首先要明確CBPS是否可以穿過細(xì)胞膜，利用流式細(xì)胞儀以及共聚焦顯微鏡技術(shù)，我們證實(shí) CBPS多肽可穿過細(xì)胞膜，存在于血小板內(nèi)部。功能研究證明

5、5μM CBPS處理血小板30秒即可誘導(dǎo)血小板Sema4D-鈣調(diào)蛋白復(fù)合體的解離，同時，我們觀察了CBPS對Sema4D分子切割的影響，結(jié)果顯示，CBPS誘導(dǎo)Sema4D切割并且呈現(xiàn)濃度、時間依賴性。而且，CBPS誘導(dǎo)的這種切割不依賴于血小板活化和ADAM17的活性增加。
　　鈣調(diào)蛋白在細(xì)胞內(nèi)以游離形式或者結(jié)合形式存在，兩種形式之間保持一動態(tài)平衡。CBPS進(jìn)入血小板內(nèi)部，與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，打破動態(tài)平衡，導(dǎo)致一些結(jié)合形式的鈣調(diào)蛋白轉(zhuǎn)變

6、為游離形式，誘導(dǎo)Sema4D分子切割，同時我們也檢測到CBPS可以誘導(dǎo)其他膜蛋白受體（如GPIbα、GPVI）切割，然而，我們的結(jié)果顯示，5μM的CBPS就可以誘導(dǎo)Sema4D分子切割，而誘導(dǎo)GPVI和GPIbα切割則分別需要10μM和20μM，說明CBPS對三種分子切割的敏感性不同，這也提示我們鈣調(diào)蛋白調(diào)控切割機(jī)制的普遍性與復(fù)雜性共存。利用鈣調(diào)蛋白抑制劑 W7進(jìn)一步證明了鈣調(diào)蛋白調(diào)控Sema4D切割這一生物現(xiàn)象。
　　以上我們是

7、采用血小板為模型進(jìn)行鈣調(diào)蛋白調(diào)控切割的研究，我們認(rèn)為這種現(xiàn)象也存在于其他細(xì)胞中，而且之前有文獻(xiàn)表明在淋巴細(xì)胞中，Sema4D自發(fā)切割產(chǎn)生可溶性片段。因此，我們通過基因突變方法，構(gòu)建了 Sema4D突變質(zhì)粒，刪除Sema4D分子鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序，從而阻止Sema4D與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)刪除鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序后Sema4D分子的自發(fā)切割明顯增加。這一結(jié)果支持之前報(bào)道的自發(fā)切割現(xiàn)象。
　　綜上所述，我們的研究