軸突導(dǎo)向分子Sema4D與整聯(lián)蛋白αIIbβ3相互作用參與血小板活化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探究血小板表面Sema4D與整聯(lián)蛋白αIIbβ3之間的相互作用對(duì)血小板活化的影響，并研究?jī)蓚€(gè)蛋白之間的結(jié)合位點(diǎn)。
　　方法：⑴免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，分別使用抗Sema4D抗體、αIIb抗體、β3抗體進(jìn)行IP，Western blot檢測(cè)；⑵將Sema4D、αIIb質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光方法研究蛋白間的位置關(guān)系；⑶抗體阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sema4D抗體阻斷FITC-CD41抗體與αIIb結(jié)合；⑷突變Sema4D全長(zhǎng)質(zhì)粒研究

2、Sema4D與αIIbβ3的結(jié)合位點(diǎn)；⑸合成Sema4D胞外PSI結(jié)構(gòu)域的多肽IBPS，生物素—親和素實(shí)驗(yàn)證明多肽與αIIb間作用；⑹蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽的酶活性。
　　結(jié)果：利用免疫共沉淀的方法證明血小板表面Sema4D與整聯(lián)蛋白αIIbβ3結(jié)合，并且在αIIbβ3活化后，結(jié)合增強(qiáng)；進(jìn)一步研究表明Sema4D胞內(nèi)段缺失突變后，不影響兩者結(jié)合，提示結(jié)合位點(diǎn)存在于Sema4D的胞外段。通過(guò)對(duì)Sema4D的胞外段的序

3、列分析發(fā)現(xiàn)其PSI結(jié)構(gòu)域含有整聯(lián)蛋白αIIb的類似序列，提示可能對(duì)配受體結(jié)合起重要作用。因此我們體外合成了PSI結(jié)構(gòu)域中與整聯(lián)蛋白相似的一段長(zhǎng)30個(gè)氨基酸殘基的多肽（IBPS），并證明IBPS與αIIb結(jié)合，提示了可能的結(jié)合位點(diǎn)。此外，IBPS存在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性保守序列“CXXC”，并證明該多肽具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶酶活性。
　　結(jié)論：該研究提出了血小板表面Sema4D與整聯(lián)蛋白αIIbβ3之間的相互作用可能介導(dǎo)血小板活化