軸突導向分子Sema3F通過其受體NRP2抑制結直腸癌生長和淋巴道轉移的機制研究.pdf

1、腫瘤轉移是癌癥患者死亡的重要原因,癌細胞主要通過血道和淋巴道播散。大腸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤,早期局部淋巴結轉移十分常見,但其分子機制尚不十分清楚。近年已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C和-D)激活其受體VEGFR3信號通路可誘導腫瘤淋巴管生成,從而影響腫瘤的轉移。但也存在某些令人困惑的現(xiàn)象。比如,雖有些癌組織中可檢測到VEGF-C表達,卻并未觀察到有明顯的新生淋巴管形成,提示除VEGF-C及其受體VEGFR3參與外,還可能受

2、其他負性調(diào)控因素的作用。
　　 新近發(fā)現(xiàn)3型神經(jīng)軸突導向分子Sema3的兩種受體NRP1和NRP2在胚胎脈管發(fā)育中具有重要作用,其中NRP2與淋巴管發(fā)生密切相關。已發(fā)現(xiàn)在基因敲除NRP2的突變小鼠,其淋巴系統(tǒng)出現(xiàn)小淋巴管和毛細淋巴管缺乏或數(shù)量減少,而血管系統(tǒng)和其他的大集合淋巴管發(fā)育正常,提示胚胎淋巴管發(fā)育選擇性地需要NRP2的參與。研究還發(fā)現(xiàn)胚胎早期從靜脈出芽形成的原始淋巴囊并不需要NRP2參與,而在其后期從原有淋巴管內(nèi)皮出芽形

3、成新生淋巴管的過程中NRP2卻十分必需,表明NRP2對胚胎的毛細淋巴管成熟具有非常重要的作用。大腸淋巴管內(nèi)皮細胞豐富地表達NRP2。為此,我們推測大腸淋巴管內(nèi)皮細胞的NRP2表達在大腸癌淋巴管生成中可能具有重要的作用。但迄今為止,關于大腸癌細胞與高表達NRP2的淋巴管內(nèi)皮細胞間的相互作用以及NRP2對淋巴管生成的影響卻了解甚少。
　　 目前研究發(fā)現(xiàn)NRPs具有兩種功能:在神經(jīng)導向中,NRPs常與3型Sema和Plexins一起形

4、成復合物,誘導Sema信號轉導。其中NRP2只與Sema3F結合并引起對上頸神經(jīng)節(jié)(SCG)軸突的排斥。脈管生成研究發(fā)現(xiàn)NRP1作為VEGF家族協(xié)同受體,可增強VEGF165與VEGFR2的結合,加強VEGF165誘導的內(nèi)皮細胞趨化性及有絲分裂原性,誘導血管生成。這樣兩個不同的配體(Sema和VEGF)結合同一受體(NRPs),卻又介導兩個不同的過程——神經(jīng)導向和血管生成,提示這些過程可能具有共同的分子基礎。
　　 Sema也影

5、響血管,其中Sema4D在體外誘導內(nèi)皮細胞遷移和小管形成,體內(nèi)刺激血管生成,而Sema3A則抑制血管形成,推測其可能系與NRP1受體競爭性結合,抑制VEGF165誘導的血管生成有關。新近研究顯示Sema3F也可抑制表達功能性NRP2受體的黑色素瘤細胞的浸潤與轉移,并抑制血管向腫瘤內(nèi)生長。NRP2主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞,且在腸道淋巴管廣泛表達,然而Sema3F與NRP2結合對大腸癌淋巴管生成的影響及其機制仍不清楚。Sema3F是否與VE

6、GF-C競爭性結合NRP2削弱其促淋巴管生成的效應,還是通過其他機制抑制大腸癌淋巴管生成,尚有待進一步探討。
　　 因此,我們推測高表達Sema3F可能對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生抑制,通過與受體NRP2的結合發(fā)揮抑制腫瘤淋巴管生成的作用。本研究中,我們首先調(diào)研了人類結直腸腺癌中Sema3F和NRP2的表達狀況,探尋兩者與淋巴管生成和淋巴道轉移相關的腫瘤病理學特征之間的關系。我們通過體外構建Sema3F shRNA干擾載體,將其與Sem

7、a3F全長載體分別轉染人結直腸癌細胞系,體外重點觀測Sema3F的表達對結直腸癌細胞株增殖、遷移、粘附、凋亡等的影響;體內(nèi)建立Sema3F轉染細胞原位移植瘤和轉移瘤模型,重點觀測Sema3F表達對體內(nèi)腫瘤生長和轉移的作用。另一方面,分離培養(yǎng)人淋巴管內(nèi)皮細胞,并構建針對NRP2的shRNA干擾載體和表達載體,轉染淋巴管內(nèi)皮細胞后,觀察NRP2表達對淋巴管內(nèi)皮細胞生長、遷移、小管成型等影響。
　　 結果
　　 1.結直腸癌組

8、織Sema3F及受體NRP2的表達與腫瘤的進展和轉移密切相關:
　　 ①結直腸癌組織部分表達Sema3F。腫瘤組織中Sema3F的mRNA表達顯著地低于癌旁粘膜組織(P＜0.05);轉移組腫瘤組織與未轉移組的腫瘤組織相比,Sema3F蛋白的表達情況卻顯著降低(P＜0.05)。②腫瘤組織中NRP2的mRNA表達顯著地高于癌旁粘膜組織(P＜0.05);轉移組腫瘤組織NRP2的mRNA表達水平也高于轉移組腫瘤對應的癌旁粘膜組織(P＜0

9、.05);未轉移組腫瘤NRP2的mRNA表達也顯著地高于對應癌旁組織(P＜0.05);轉移組腫瘤組織與未轉移組的腫瘤組織相比,NRP2顯著地增高(P＜0.05)。NRP2蛋白在腫瘤組織內(nèi)的總體表達陽性率為54.2％;且發(fā)生淋巴管侵犯和淋巴結轉移的病例表達率為100％。在正常粘膜,NRP2幾乎檢測不到有表達,而腫瘤組織則呈現(xiàn)較強的胞漿表達。腫瘤組織NRP2的表達與腫瘤的轉移狀態(tài)密切相關(P＜0.05)。③Sema3F的高表達與腫瘤浸潤程度

10、、分化程度等惡性生物學行為特征和淋巴管侵犯、局部淋巴結轉移以及Dukes分期等影響腫瘤轉移的特征呈現(xiàn)負相關關系(P＜0.05)。NRP2的表達則與腫瘤浸潤深度、血管侵犯、淋巴管侵犯、局部淋巴結轉移和Dukes分期有較為密切的關系(P＜0.05)。④腫瘤微淋巴管存在隨瘤體部位不同而改變的特點,呈現(xiàn)出分布、形態(tài)和數(shù)量(微淋巴管密度)的差異。腫瘤內(nèi)微淋巴管密度(MLD)值與Sema3F表達呈顯著的負性相關關系(P＜0.05),隨著腫瘤Duke

11、s分期的進展,Sema3F的總體表達強度逐漸下降,而MLD值則顯著抬升(P＜0.05)。
　　 2.NRP2表達具有促進淋巴管生成作用:
　　 ①采用免疫磁珠法成功分離的LEC,形態(tài)學上具有典型的內(nèi)皮細胞“鋪路石”狀生長特征,表達包括D2-40、LYVE-1、podoplanin和VEGFR3等多種較為特異的淋巴管內(nèi)皮標記物。不表達vWF、CD31等常見血管內(nèi)皮標記;②LEC對VEGF-C促增殖具有良好的生物學反應;直接

12、上調(diào)LEC中NRP2的表達株pLEC,在未添加10 ng/ml VEGF-C時,增殖能力較LEC即有增長(P＜0.05);而在相同劑量(10 ng/ml)的VEGF-C誘導下,pLEC株則顯示出最為活躍的增殖能力(P＜0.05);干擾NRP2后,iLEC株增殖并未受到明顯影響,而添加VEGF-C對iLEC增殖雖然有明顯的刺激作用(P＜0.05),但增殖能力與LEC刺激組也無明顯差異(P＞0.05);⑨當通過表達載體上調(diào)NRP2在LEC中

13、的表達后,pLEC株約48 h就開始顯示出小管形成能力的增強,其小管形成的速度明顯較對照組快。而iLEC株在實驗結束時,仍不能形成典型、完整的小管樣結構。提示:NRP2表達水平的改變,可以顯著影響LEC在體外形成小管樣結構的能力;④上調(diào)NRP2的pLEC株在各組細胞中具有最強的遷移能力。pLEC株中遷移細胞的數(shù)量幾乎是cLEC組的149％,重復實驗統(tǒng)計證實兩者之間存在顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。當采用shRNA干擾下調(diào)NRP2在L

14、EC中的表達后,相應的iLEC細胞株運動能力也受到嚴重的影響。較之cLEC細胞而言,iLEC細胞的遷移細胞數(shù)僅為對照的84％,但兩者之間并無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);⑤使用200 ng/ml的VEGF-C作為趨化源后,我們發(fā)現(xiàn)與EBM-2對照組比較,添加了招引物VEGF-C的實驗組均產(chǎn)生數(shù)量更多的遷移細胞(P＜0.05),說明VEGF-C對原代培養(yǎng)的LEC細胞確實可以產(chǎn)生誘導趨化的效果。進一步在實驗組中比較cLEC株,我們發(fā)現(xiàn)無論是p

15、LEC株還是iLEC株,細胞遷移的數(shù)量與cLEC都有顯著地差異(P＜0.05);⑥上調(diào)NRP2的表達后,pLEC中整合素α9亞基的mRNA表達水平并無顯著變化,而β1亞基的mRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05);而干擾NRP2表達的iLEC中整合素α9亞基的mRNA表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05),而β1亞基的mRNA水平顯著下降(P＜0.05)。進一步研究整合素蛋白表達水平的變化,發(fā)現(xiàn)上調(diào)NRP2的表達后,pLEC中整合素α9亞基顯著下

16、調(diào)(P＜0.05),而β1亞基的rnRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05);而干擾NRP2表達的iLEC中整合素α9亞基和β1亞基的水平均顯著下調(diào)(P＜0.05)。整合素水平的變化可能是NRP2調(diào)控上述LEC生物學行為的根本機制。
　　 3.上調(diào)Sema3F的表達呈現(xiàn)出抗腫瘤效應
　　 ①上調(diào)Sema3F的表達可以顯著地降低SW480細胞株的增殖能力(P＜0.05),而干擾其表達則顯著地促進瘤細胞的增殖(P＜0.05)。雙轉

17、NRP2表達載體后,瘤細胞的增殖并未受其顯著地影響。②腫瘤細胞內(nèi)Sema3F過表達后,處于S期的細胞比例顯著降低,而干擾Sema3F,S期細胞比例則顯著增加。然而各組間的總體凋亡率并沒有顯著改變;③上調(diào)Sema3F表達水平的移植瘤生長速率明顯減緩,體積明顯縮小;進一步研究發(fā)現(xiàn)瘤細胞增殖活性較低。④上調(diào)Sema3F的腫瘤細胞(SW480-A)接種60 min后,開始顯示出較對照細胞明顯降低的粘附能力(P＜0.05)。而調(diào)控NRP2的表達狀

18、態(tài)并沒有顯著改變瘤細胞的基質(zhì)粘附水平;⑤下調(diào)Sema3F表達水平的細胞(SW480-C)較之對照組和上調(diào)組細胞顯示出運動能力的低下;⑥Sema3F的表達上調(diào)了腫瘤內(nèi)整合素αvβ3的水平,而Sema3F的表達在RNA干擾之后,減弱了整合素αvβ3上調(diào)的程度;
　　 4.Sema3F的表達使得移植瘤淋巴管生成及轉移受到抑制:
　　 ①單獨上調(diào)Sema3F的SW480-A0細胞株,移植瘤內(nèi)淋巴管密度與對照SW480-Par組比

19、較無明顯差異,但同時上調(diào)NRP2的SW480-A2株所形成的移植瘤,淋巴管生成的抑制則較為明顯(P＜0.05)。另一方面,針對Sema3F的shRNA干擾可以顯著地增加腫瘤內(nèi)淋巴管生成的程度(P＜0.05)。單純下調(diào)Sema3F的SW480-C0株,瘤內(nèi)淋巴管密度較SW480-A0組比較無明顯差異(P＜0.05),而在此基礎上同時轉染NRP2,則進一步促進了瘤內(nèi)淋巴管的生成,SW480-C6形成的移植瘤內(nèi)毛細淋巴管密度顯著增加(P＜0.

20、01);②上調(diào)Sema3F對腫瘤的轉移也能產(chǎn)生抑制,但這種效應需要NRP2的參與。另一方面,干擾Sema3F而上調(diào)NRP2后,腫瘤轉移幾率明顯增加。
　　 結論：
　　 (1)人結直腸癌中Sema3F表達水平下調(diào)與腫瘤發(fā)生進展密切相關,高表達Sema3F將導致瘤細胞增殖、遷移、粘附能力的下降從而抑制腫瘤細胞的生長和播散。
　　 (2)NRP2的表達通過增強淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、趨化和小管形成的能力可顯著地促進