JNK3與p65相互作用的分子機(jī)制及其功能研究.pdf

1、本課題是在用高通量酵母雙雜交技術(shù)篩選誘餌蛋白c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinases 3，JNK3)在人肝臟eDNA文庫相互作用蛋白結(jié)果上的深入研究，p65是篩選到的JNK3的獵物之一。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)超家族成員之一。在脊椎動物

2、，JNK由jnk1、jnk2、jnk3三種基因編碼，表達(dá)的JNK1、JNK2、JNK3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在成人大腦中，這三種蛋白激酶的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于剪切方式的不同有10種亞型。JNK3與JNK1和JNK2的不同在于：JNK3有一個(gè)與位于JNK1和JNK2的N末端保守的甲硫氨酸殘基融合在一起的延長的N末端區(qū)域；JNK1和JNK2在組織內(nèi)廣泛表達(dá)，JNK3在腦、心臟、睪丸等組織特異表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)JNK3參

3、與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，可促進(jìn)缺血、缺氧、有毒化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 核因子κB(nuclear factor of kappa B，NF-κB)是一組重要的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB復(fù)合體是由Rel家族不同成員組成的二聚體。Rel家族包括RelA(p65)，c-Rel，RelB，NF-κB1(p105)和NF-κB2(p100)五個(gè)成員，蛋白酶水解NF-κB1和NF-κB2產(chǎn)生p50和p52。最常見的是p50/p65二聚體。在

4、大多數(shù)細(xì)胞中，這些二聚體與抑制蛋白IκB(主要成分為IκB-α)結(jié)合成無活性的三聚體存留于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，IKK首先被激活，磷酸化IκB-α使其失活，IκB-α與p50/p65復(fù)合體解離，p50/p65進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。 JNK3激酶與p65蛋白在TNF-α活化的細(xì)胞凋亡信號通路里通過啟動不同的下游靶基因來發(fā)揮互相拮抗的作用。TNF-α與其受體結(jié)合后，引起細(xì)胞內(nèi)死亡區(qū)相聚，此后TNFR相關(guān)死亡區(qū)蛋白

5、(TRADD)再結(jié)合其上。TRADD的作用猶如一個(gè)平臺，一面結(jié)合FADD并激活半胱氨酰天冬氨酸特異蛋白8(caspase 8)，進(jìn)而激活其它c(diǎn)aspase家族成員，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一面結(jié)合受體相互作用蛋白(RIP)，后者再結(jié)合TNFR相關(guān)因子2(TRAF2)，TRAF2是連接JNK通路和NF-κB通路的樞紐蛋白，既可激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，又可激活JNK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但是JNK3激酶與P65蛋白的直接相

6、互作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道，這是我們得到的一個(gè)非常有意義的發(fā)現(xiàn)。由于酵母雙雜交技術(shù)本身存在著缺陷，難免出現(xiàn)假陽性，首先要運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)手段對JNK3激酶與P65蛋白相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。 我們通過酵母回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了JNK家族成員JNK1、JNK2和JNK3與p65的相互作用，結(jié)果只有JNK3與p65回轉(zhuǎn)結(jié)果陽性，確定了開展JNK3與p65相互作用研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 隨后構(gòu)建了攜帶FALG標(biāo)簽的JNK3和攜帶Myc標(biāo)簽的p65真核表達(dá)載

7、體，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證JNK3和p65相互作用。用FALG抗體進(jìn)行免疫沉淀，對免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行Western Blot，用Myc抗體檢測，結(jié)果在沉淀復(fù)合物中檢測到了p65，而在對照中未檢測到p65，從而在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了JNK3與p65存在相互作用。由于p65在細(xì)胞中是組成性表達(dá)的，在HEK293細(xì)胞中有很強(qiáng)的內(nèi)源p65表達(dá)，用攜帶FLAG標(biāo)簽的JNK1、JNK2和JNK3融合蛋白與HEK293細(xì)胞內(nèi)源p6

8、5進(jìn)行半內(nèi)源免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，用p65特異抗體進(jìn)行免疫沉淀，對免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行Western Blot，用FLAG抗體檢測，結(jié)果在沉淀復(fù)合物中只有JNK3和p65有相互作用，進(jìn)一步確定了JNK3與p65相互作用的特異性。構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白的JNK3和紅色熒光蛋白的p65真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果JNK3和p65共定位于細(xì)胞漿，確定了/NK3和p65在細(xì)胞內(nèi)相互作用的部位。 由于JNK3只有

9、一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，而p65有Rel同源結(jié)構(gòu)域(Relhomology domain，RHD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)成(transactivation domain，TAD)兩個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域。為了驗(yàn)證JNK3與p65相互作用的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了表達(dá)GST-JNK3融合蛋白的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL-21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，GST-JNK3融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)過變性和復(fù)性，得到了可溶性GST-JNK3融合蛋白；按結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了一系列p65截短體的

10、真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得了p65截短體的真核細(xì)胞表達(dá)蛋白，通過GST-pull down實(shí)驗(yàn)確定了JNK3與p65 RHD結(jié)構(gòu)域的(201-312)位氨基酸區(qū)域發(fā)生相互作用。 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測JNK3與p65相互作用對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。3×κB-luc是含有3個(gè)κB位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用表達(dá)Myc-JNK3融合蛋白的質(zhì)粒與其共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，JNK3能明顯抑制NF-κB報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄

11、活性；轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-p65質(zhì)粒提高細(xì)胞內(nèi)p65蛋白水平，給細(xì)胞加入TNF-α或IL-1β刺激，均可明顯激活NF-κB報(bào)告基因，JNK3對激活的NF-κB報(bào)告基因有明顯抑制作用，且隨著JNK3轉(zhuǎn)染量的增加，抑制程度增加。用NF-κB轉(zhuǎn)錄因子啟動的下游靶基因E-selectin、ICAM-1、IFN-β、IL-6的含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的啟動子構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步檢測JNK3對NF-κB的靶基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。在加入TNF-

12、α刺激后，E-selectin-luc、ICAM-1-luc、IFN-β-luc、IL-6-luc均被激活，JNK3可明顯抑制E-selectin-luc和ICAM-1-luc報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，且隨著JNK3轉(zhuǎn)染量的增加，抑制程度增加；但是JNK3對IFN-β-luc和IL-6-luc報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯抑制作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果說明JNK3可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄，但是JNK3對NF-κB靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制是有選擇性的，J

13、NK3抑制與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因E-selectin和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄，而對炎癥因子IFN-β和IL-6的轉(zhuǎn)錄沒有影響，該選擇性是與JNK3的功能相關(guān)的，提示JNK3可能是一腫瘤抑制基因。 為了驗(yàn)證JNK3對p65轉(zhuǎn)錄活性的抑制是否依賴其激酶活性，分別將野生型JNK3和突變失活型JNK3與3×κB-luc熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加入IL-1β刺激可明顯激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，野生型JNK3和突變失活型

14、JNK3均可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄；由于IL-1β同時(shí)也是JNK3的激活劑，與突變失活型JNK3相比，野生型JNK3對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的抑制更為明顯，說明JNK3對p65轉(zhuǎn)錄活性的抑制部分依賴其激酶活性，JNK3可能對p65進(jìn)行了磷酸化，從而抑制了其轉(zhuǎn)錄活性，但是該結(jié)論還需體外激酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。 EMSA實(shí)驗(yàn)檢測JNK3對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合能力的影響。在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-p65質(zhì)粒或在收細(xì)胞前6h加入TNF-α刺

15、激均可增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力，與pCMV-Myc對照相比JNK3可明顯削弱NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力，且隨著JNK3轉(zhuǎn)染量的增加，NF-κB的DNA結(jié)合能力逐漸下降。對分離的細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白進(jìn)行Western Blot，檢測JNK3對p65核移位的影響，結(jié)果JNK3對p65核移位沒有明顯影響。提示JNK3與p65相互作用抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力是JNK3抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的可能機(jī)制。

16、 為了進(jìn)一步研究JNK3與p65相互作用的功能，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)JNK3的HEK293細(xì)胞株，JNK3能明顯促進(jìn)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞株為進(jìn)一步研究JNK3與p65相互作用的功能提供了基礎(chǔ)。 本課題通過對JNK3與p65相互作用的驗(yàn)證和功能研究，得出JNK3與p65 RHD結(jié)構(gòu)域的(201-312)位氨基酸區(qū)域發(fā)生相互作用，JNK3抑制了p65的DNA結(jié)合能力，從而抑制了NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，提出JN