腦組織特異表達鈣結合蛋白-D28k轉基因小鼠的制備與鑒定.pdf

1、鈣結合蛋白-D28K(Calbindin D-28k，CaBP-D28k)是鈣結合蛋白家族重要成員，廣泛分布于神經系統(tǒng)，能通過與鈣離子、胱天蛋白酶-3、細胞膜三磷酸腺苷二脂酶和P38等結合調控其活性。在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者腦黑質致密區(qū)存在少量抗變性能力很強的DA能神經元細胞，其共同特征是胞漿內都含CaBP。在遇到缺血和神經興奮性毒性時，CaBP陽性神經元細胞能夠存活，提示CaBP對神經細胞具有保護

2、作用。細胞凋亡是包括PD在內的許多神經系統(tǒng)疾病中神經元細胞退行性病變的重要方式，而胞內鈣離子超載是神經元細胞發(fā)生凋亡的誘因之一。作為一種鈣離子快速緩沖蛋白，CaBP通過與鈣離子結合對各種生物化學信號發(fā)生反應，限制細胞內游離鈣離子濃度的過度升高，作為酶激活劑激活Ca2+-ATP酶調節(jié)鈣離子的濃度，通過調節(jié)離子通道來促進鈣離子的擴散，在神經元細胞出現長時間高強度神經活動時保護細胞免受鈣超載的損害。增加DA神經細胞內CaBP量可防止其產生退行

3、性病變，達到治療PD的目的。對于如何增加DA神經細胞內CaBP的量，目前主要局限于體外細胞水平和以病毒為載體的體內短暫表達，而CaBP-D28k在DA神經細胞內表達的轉基因動物模型未見報道，對DA神經細胞保護機制還需進一步研究。
　　 本研究用腦組織特異酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)基因啟動子構建CaBP-D28k表達載體，用二甲基亞砜(DMSO)處理精子制備轉基因小鼠，建立用于PD研究的轉基因動

4、物模型。首先，根據發(fā)表的小鼠TH啟動子序列設計引物，用重疊PCR擴增小鼠TH啟動子，測序正確后構建重組表達質粒pTH-EGFP，用脂質體分別轉染TH+MN-9D細胞和TH-ECV細胞，根據EGFP報告基因的表達與否來驗證TH啟動子的調控能力。在此基礎上，用PCR克隆5個不同的TH啟動子基因片段，用相同策略獲得能驅動外源基因在腦組織中特異表達的TH啟動子核心序列。然后，用RT-PCR從小鼠腦組織中擴增CaBP-D28k cDNA，將其克隆

5、入含TH啟動子的表達載體，獲得的重組載體pTH-CB經脂質體包裹后轉染MN-9D細胞，用RT-PCR、免疫沉淀法檢測CaBP-D28k的表達，用6-羥多巴胺復制細胞凋亡模型，用細胞原位免疫印跡法檢測轉染細胞中抗凋亡因子bcl-2的表達，用Hoechst染色、胱天蛋白酶-3活性檢及鈣依賴性磷脂結合蛋白Annexin V/PI檢測法，評價CaBP的抗細胞凋亡作用。進而將DMSO處理的精子與pTH-CB孵育，將體外受精獲得的胚胎移植小鼠，用W

6、estern blot等試驗檢測PCR檢測轉基因陽性鼠黑質部CaBP-D28k表達，用MPTP復制PD模型，通過自主活動、游泳實驗、懸掛實驗等研究轉基因鼠的行為學以及黑質致密部TH陽性細胞數的改變，來驗證CaBP的抗MPTP對神經細胞的損傷作用。結果表明，克隆的TH啟動子為3650bp，其序列與發(fā)表的TH啟動子序列完全一致，能驅動EGFP報告基因在MN-9D細胞中表達。用PCR擴增的450bp、1500bp、2000bp、2400bp、

7、3650bp TH啟動子序列構建報告載體，其轉染的MN-9D細胞培養(yǎng)中EGFP陽性細胞的比例無統(tǒng)計學顯著性差異(分別為8.01％、7.97％、7.85％、7.72％、7.74％)，但在其轉染的TH-ECV細胞培養(yǎng)中，EGFP陽性細胞比例分別為6.51％、6.35％、6.71％、0.89％、1.02％，3650bp和2400bp啟動子在TH-細胞中的表達調控能力受到明顯抑制，初步證明TH啟動子中組織特異性調控元件主要位于2400bp～20

8、00bp區(qū)域。
　　 用RT-PCR從小鼠腦組織中擴增的785bp CaBP-D28k cDNA與已報道的序列完全一致，用TH啟動子調控的CaBP-D28k表達載體轉染MN-9D細胞，其CaBP-D28k mRNA及蛋白表達量顯著高于對照組，表達的CaBP能顯著促進細胞內bcl-2表達，能抑制Caspase-3活性，并能顯著降低細胞的凋亡數。
　　 用DMSO處理的精子共獲得96只后代小鼠，其中4只為PCR檢測陽性，2只

9、能穩(wěn)定傳代目的基因，其腦黑質部、腹側被蓋區(qū)的CaBP-D28k表達量顯著高于正常小鼠，而其海馬、大腦皮層的CaBP-D28k表達量與正常鼠無明顯差異，初步說明TH啟動子能驅動外源CaBP-D28k基因在DA神經細胞中表達，獲得了腦組織特異表達CaBP-D28k的轉基因小鼠品系。MPTP造模試驗結果表明，轉基因鼠黑質致密部TH陽性細胞數和行為學變化差異不顯著，而正常鼠黑質致密部TH陽性細胞數和行為學變化差異顯著，表明腦內DA神經細胞中Ca