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文檔簡介
1、很多研究將Sertoli細胞在神經(jīng)前體細胞分化中的作用歸結為Sertoli細胞分泌的細胞因子和營養(yǎng)因子等分泌物上,而從Notch信號轉導系統(tǒng)角度,通過Noch受體與配體的相互作用,來探討細胞與細胞間的相互接觸在神經(jīng)前體細胞分化中的意義,國內外尚未見報道。因而我們從Notch信號轉導相關分子方面,對Sertoli細胞在神經(jīng)前體細胞分化作用機理進行了深入研究。現(xiàn)將四部分內容分述如下: 第一部分:大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞的分離培養(yǎng)及其
2、增殖分化特性鑒定 目的:神經(jīng)前體細胞是一類具有多向分化潛能和自我復制能力,在特定條件下,能夠向特定類型神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞分化的細胞。本實驗通過體外分離和培養(yǎng)大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞,對神經(jīng)前體細胞增殖和分化特性進行鑒定。 方法:分離2周齡大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng),使用免疫細胞熒光染色技術對細胞的分化特性進行鑒定。 結果:誘導神經(jīng)前體細胞增殖的有絲裂原包
3、括堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子等。我們的實驗結果表明EGF、bFGF和GDNF可促進神經(jīng)前體細胞的增殖及神經(jīng)球的克隆形成,并獲得了Nestin陽性的神經(jīng)前體細胞,其可分化為分別表達β-Ⅲ tubulin、GFAP和GalC的陽性細胞。 結論:神經(jīng)前體細胞在體外大量擴增后,植入腦組織內或通過基因重組后再植入腦內,可用來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如帕金森病或阿爾茨海默病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)前體細胞的增殖與分化是一個復雜的進程,存在細
4、胞自身基因調控和外來信號調控兩種機制。因而,目前需要積極尋找可靠的方法來有效地分離和擴增神經(jīng)前體細胞,并精確地了解其增殖與分化特性。本研究第一部分利用大鼠的大腦皮質分離培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞,觀察了bFGF、EGF和GDNF三種生長因子對神經(jīng)前體細胞在體外培養(yǎng)增殖和分化的影響,體外分離和培養(yǎng)的大腦皮質神經(jīng)前體細胞,在含EGF、bFOF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中培養(yǎng),具有不斷增殖和多向分化的能力,符合神經(jīng)前體細胞的特點,為神經(jīng)前體細胞的定向分化
5、研究奠定了基礎。 第二部分:Sertoli細胞對大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞的誘導分化作用研究 目的:同一來源的神經(jīng)前體細胞移植到不同部位后,其分化結果也不相同,但往往與接受移植部位的細胞相似,提示外來信號調控作用的重要性。而且,在不同因素影響下,神經(jīng)干細胞還具有橫向分化潛能。本部分主要研究Sertoli細胞對體外培養(yǎng)大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞生長分化的作用特點,及向多巴胺能神經(jīng)元分化的誘導作用。 方法:將大鼠Sert
6、oli細胞與14d大鼠皮質神經(jīng)前體細胞體外共培養(yǎng),免疫組化檢測神經(jīng)干細胞標記物Nestin,神經(jīng)元、星形膠質細胞和小膠質細胞標記物β-Ⅲ tubulin、GFAP和GalC,及多巴胺能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶(TH)的表達情況。 結果:隨著共培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)干細胞中GFAP陽性細胞數(shù)量逐漸減少,而β-Ⅲ tubulin陽性細胞數(shù)增多,并出現(xiàn)TH陽性的神經(jīng)元。 結論:把胎鼠或成年鼠前腦神經(jīng)干細胞移植給經(jīng)亞致死量照射破壞
7、了造血系統(tǒng)的同種宿主的骨髓,發(fā)現(xiàn)后者出現(xiàn)了供者源性的骨髓樣細胞、淋巴細胞和早期的造血干細胞;把從人胚胎和成年小鼠快速分離的神經(jīng)干細胞與成肌細胞共培養(yǎng),結果神經(jīng)前體細胞分化為骨骼肌細胞。證實了神經(jīng)干細胞有著更大的分化潛能。Clarke等發(fā)現(xiàn),成年鼠腦的干細胞能在雞胚環(huán)境中被誘導形成所有的胚層。這些研究結果顯示,環(huán)境的指導性信號對神經(jīng)干細胞分化的重要作用。我們的實驗結果表明:Sertoli細胞抑制體外培養(yǎng)的大鼠皮質神經(jīng)前體細胞的生長,但具有
8、顯著的促神經(jīng)元分化的作用,并能夠誘導與其共培養(yǎng)的大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元。 第三部分:Sertoli細胞共培養(yǎng)大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞分化中Notch信號相關基因表達分析 目的:對那些在發(fā)育期調控細胞決定和細胞分化的基因進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)Notch信號轉導通路是具備這些功能的重要家族之一。它在大量的組織和器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用,調控著組織類型及形態(tài)的發(fā)生。本部分研究主要檢測與Srtoli細胞共培養(yǎng)
9、條件下大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞分化過程中Notch信號相關分子的表達變化,分析Notch信號途徑在神經(jīng)前體細胞分化過程中的可能作用。 方法:本實驗通過神經(jīng)前體細胞與Srtoli細胞共培養(yǎng),用Real-timePCR相對定量法,以β-actin為內對照,分別檢測Notch受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4,及其酉己體Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及Hes 1、Ngn1基因的表
10、達變化。 結論:在干細胞發(fā)育過程中,細胞膜表面分子Notch通過結合其配體Delta或Jagged而在干細胞和周圍細胞間傳遞信號,這種細胞間的相互作用可以調控干細胞的分化。在哺乳動物,Notct1信號通過CBF 激活E(sp1)的同源物Hes[Hairy and E(sp1)]1/5,并影響Ngn(Neurogeilins)等前神經(jīng)因子的表達,從而調節(jié)神經(jīng)干細胞的分化。Notch在細胞間傳導相互作用的信號,并通過這種鄰近細胞間的
11、信號傳遞來精確調控各譜系細胞分化。Notch信號通路在哺乳動物CNS發(fā)育中參與神經(jīng)發(fā)生過程,決定著CNS祖細胞是選擇繼續(xù)增殖還是向神經(jīng)元分化。一般而言,Notch信號轉導通路的激活維持神經(jīng)干細胞的穩(wěn)定狀態(tài),抑制定向分化:但另一方面,也有證據(jù)表明激活Notch信號轉導通路又可以加速并不可逆地促進神經(jīng)干細胞向成膠質細胞分化。本研究。 第三部分應用實時熒光定量PCR法,檢測了與sertoli細胞共培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞分化過程中Notch相
12、關基因Notch1~4、Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2、hes1和ngn1的表達變化,實驗表明在與sertoli細胞共培養(yǎng)條件下,神經(jīng)前體細胞的分化特點與Notch信號相關分子的表達變化相關。Sertoli細胞可通過N0tch配體的作用,調節(jié)神經(jīng)前體細胞N0tch信號分子的表達。在共培養(yǎng)條件下,Sertoli細胞對神經(jīng)前體細胞Hesl表達有抑制作用,但對Ngn1有正向調節(jié)作用,從而影響神經(jīng)前體細胞的分化。
13、 第四部分:Hes1基因真核表達載體的構建及瞬時表達在大腦皮質神經(jīng)前體細胞分化中的作用 目的:隨著神經(jīng)前體細胞分離、提純及體外培養(yǎng)等研究的深入,對內在和外在因子控制神經(jīng)前體細胞增殖和分化的研究也取得了顯著進步。目前研究證明,發(fā)生在不同組織內的同一機制調控著該關鍵步驟,而其中涉及最多者為bHLH基因家族。bHLH是一組轉錄因子,通過一個堿性區(qū)域和一個HLH域的異二聚化與DNA形成特定的接觸。Notch信號的下游基因E(sp1)
14、Htes就是其中之一。本實驗通過克隆大鼠Hes1基因并構建真核表達載體pCDNA3.1-Hes1,將重組質粒轉染大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞,獲得高表達Hesl基因的神經(jīng)前體細胞克隆。以探討Hes1基因高表達對神經(jīng)前體細胞分化的影響。 方法:從大鼠腦組織中提取總RNA,用RT-PCR方法獲得Hes1基因的全長cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆載體中進行序列測定,測序正確后將其亞克隆至表達載體pCDNA3.1,利用脂質體將重組質
15、粒轉染原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞,經(jīng)G418篩選獲得抗性細胞克隆,采用RT-PCR方法鑒定Hesl基因在神經(jīng)前體細胞基因組中的存在,實時熒光定量PCR檢測Hes1基因的過表達情況。 結果:經(jīng)限制性內切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實目的基因己插入重組質粒,RT-PCR證明經(jīng)G418篩選得到的轉基因神經(jīng)前體細胞克隆的基因組DNA中存在Hes1基因,實時熒光定量PCR進一步證明轉基因神經(jīng)前體細胞Hes1基因的mRNA呈高表達。
16、 結論:不同的bHLH因子具有不同的決定和分化的功能,經(jīng)常作為一個相關蛋白質家族而存在,按時空順序短暫表達于細胞系分化的不同階段。早期表達因子參與祖細胞的決定,而晚期表達因子則參與分裂細胞的終期分化,早期表達蛋白質激活晚期蛋白質表達。研究顯示,Notch和它的下游效應器Hes基因,以及同源基因Emx2具有維持腦內多潛能干細胞狀態(tài)的功能,而Ngn1/2和Mash1和Pax6是神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化的必要條件。Kabos等發(fā)現(xiàn)阻斷Hesl
17、表達促進中樞神經(jīng)干細胞分化為γ-氨基丁酸神經(jīng)元。神經(jīng)元形成后,Hes因子的激活促進星形膠質細胞的分化,而前神經(jīng)bHLH因子Ngn抑制星形膠質細胞的分化。本實驗通過克隆大鼠Hes1基因,構建真核表達載體pCDNA3.1-Hes 1,并將重組質粒轉染大鼠大腦皮質神經(jīng)前體細胞,研究觀察了Hes 1基因過表達對神經(jīng)前體細胞Ngn1表達的影響,以及這些變化在神經(jīng)前體細胞分化的作用。實驗成功構建了大鼠Hes 1基因的真核表達載體,獲得了穩(wěn)定表達He
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