Rho-ROCK分子與合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜脫落及重度子癇前期發(fā)病關(guān)系的研究.pdf

1、背景和目的：重度子癇前期(severe preeclampsia，sPE)是嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦和胎兒健康的重要產(chǎn)科并發(fā)癥之一。由于目前的研究成果尚不能對sPE的發(fā)病進行準(zhǔn)確預(yù)測，而精確調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為以糾正sPE的解剖病理基礎(chǔ)尚無可觀前景，因此考慮如何干預(yù)、阻斷發(fā)病后的病理生理過程對于sPE的臨床治療更具意義。sPE孕婦的血清或血漿可以干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，提示sPE患者外周血中存在引發(fā)臨床癥狀的重要因子。胎盤娩出后其臨床癥狀迅速消失

2、，說明sPE外周血不良因子主要來自于胎盤。合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(syncytiotrophoblast microvillous membrane，STBM)是胎盤源性不良因子之一，是合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡或被激活時產(chǎn)生的帶膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，脫落至母體血液循環(huán)的STBM可作用于外周血管，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞失功能，同時通過調(diào)節(jié)機體炎性因子釋放和調(diào)控細(xì)胞免疫等多種途徑影響母體免疫系統(tǒng)，目前被認(rèn)為是sPE發(fā)病的重要因素。已有研究表明，sPE患者外周血ST

3、BM濃度顯著增高，在早發(fā)型sPE則更為明顯，但其脫落機制尚不清楚，值得注意的是，STBM在妊娠婦女外周血即可以測得，而在未妊娠婦女外周血中檢測不到，說明STBM的釋放行為本身是正常妊娠過程中的生理現(xiàn)象，sPE時由于某種因素的介導(dǎo)使其脫落上調(diào)，從而達到致病作用。國內(nèi)外研究提示：低氧可能是STBM脫落的主要誘發(fā)因素。
　　 Rho/ROCK信號通路由Rho亞家族蛋白(Ras homologue protein family)及其下游

4、分子ROCK(Rho-associated protein kinase)組成，廣泛參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，通過作用于下游分子參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)過程。已證實，Rho/ROCK信號通路參與sPE的發(fā)病過程，且sPE患者胎盤組織RhoA、ROCKⅡ蛋白高表達。已有研究證實低氧可激活Rho/ROCK信號通路，尤其上調(diào)RhoB和ROCKⅠ的表達。鑒于sPE發(fā)病過程中存在胎盤缺血缺氧、低灌注的這一重要病理環(huán)境，我們推測，Rho

5、/ROCK很可能參與調(diào)控sPE時低氧介導(dǎo)的STBM脫落上調(diào)，且ROCK兩種亞型在其中的作用可能不同，但目前為止，Rho亞家族蛋白及ROCK在sPE胎盤組織的亞型表達特點尚不明確，其與STBM脫落的關(guān)系及可能存在的作用機制也不明了。
　　 本研究基于體外胎盤絨毛組織低氧培養(yǎng)實驗平臺，應(yīng)用電鏡、免疫組化、Westernblot、ELISA等實驗技術(shù)，研究并探討Rho/ROCK分子與STBM脫落及sPE發(fā)病的關(guān)系。
　　 材料

6、和方法：
　　 1.研究對象及分組
　　 選擇2009年1月～2010年9月在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院和新橋醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦40例，每位患者都簽署知情同意書。重度子癇前期組(severe preeclampsia，sPE)20例，正常對照組(normal pregnancy，NP)20例，兩組孕婦年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均行剖宮產(chǎn)，均為單胎妊娠，無糖尿病、心臟病、慢性腎病、肝病以及免疫性疾病

7、等病史。
　　 2.標(biāo)本采集與預(yù)處理
　　 胎盤娩出后，無菌條件下剪取胎盤母體面中央無鈣化區(qū)組織約1.0cm3大小，棄除胎盤底蛻膜，用PBS漂洗干凈，置于無菌紗布上浸干，部分標(biāo)本置于液氮罐凍存；部分以2.5%戊二醛固定，部分以4%多聚甲醛固定。
　　 3.體外胎盤絨毛組織低氧培養(yǎng)
　　 當(dāng)胎盤娩出后避開鈣化區(qū)組織取約1.0cm3大小，用無菌生理鹽水漂洗干凈后，剪去蛻膜組織并剝離棄除血管，將絨毛組織剪成0.

8、1cm3的小塊，稱每孔的絨毛組織重量，每孔約為60mg，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加SmL培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%胎牛血清+雙抗)，分別在37℃、5%O2(體積分?jǐn)?shù))+95% N2混合氣的低氧箱和37℃、5%CO2和95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)0.5h、1h、2h、3h、6h、12h后分別收集組織及上清液。實驗組分為常氧組(Normoxia)與低氧組(Hypoxia)。
　　 4.透射電鏡樣本觀察
　　 將

9、胎盤組織樣本用2.5%戊二醛固定2h后，取出，用2%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，再行超薄切片，醋酸鈾及枸椽酸鉛雙染色，每張切片加速電壓80KV，放大倍率為10000。觀察胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)變化。
　　 5.體視學(xué)參數(shù)測算方法
　　 用Image Pro圖像分析軟件設(shè)計方網(wǎng)測試系統(tǒng)進行分析，方網(wǎng)的點間距為20個像素。測試前，首先用電鏡照片標(biāo)尺對該網(wǎng)格進行標(biāo)定，以合體滋養(yǎng)細(xì)胞為參照系，用上述方網(wǎng)測試系統(tǒng)測試擊中微絨毛及

10、包容空間的測試點數(shù)，計數(shù)測試線與微絨毛的交點數(shù)，分別計數(shù)測試，區(qū)域內(nèi)的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛數(shù)密度(numerical density，Nv，個/μm3)，表面積密度(surface density，Sv，μm2/μm3)及體積密度(volume density，Vv，μm3/μm3)，計算測試的各個體視學(xué)參數(shù)。
　　 6.免疫組化檢測RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白的定位
　　 將胎盤組織用4%多聚

11、甲醛中固定24h后，石蠟包埋、切片。采用免疫組化ABC法檢測胎盤組織中RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達。參照免疫組化試劑說明書，嚴(yán)格按照步驟進行。一抗(Rabbit polyclonal to RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅡ，1:1500；Rabbit polyclonal to ROCKⅠ，1:500)4℃過夜，以PBS液代替一抗做陰性對照，DAB染色后，用蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥。光鏡下

12、觀察組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。
　　 7.Western blot檢測RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ的表達
　　 按常規(guī)方法從胎盤組織中提取蛋白，SDS-PAGE步驟按常規(guī)操作，電泳(100 mV，1.5 h)；封閉(5%的脫脂牛奶，1h)。應(yīng)用單克隆抗體(Rabbit polyclonal to RhoA、RhoB、RhoC，1:2000；Rabbit polyclonal to ROCKⅠ、R

13、OCKⅡ，1:300)孵育，再與過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，應(yīng)用化學(xué)增強發(fā)光方法顯示條帶。應(yīng)用Quantity-one4.62軟件對凝膠電泳條帶進行灰度值分析，以目的條帶和內(nèi)參條帶的比值作為目的蛋白表達的相對含量。
　　 8.ELISA檢測STBM的脫落水平
　　 應(yīng)用STBM表面標(biāo)記.人胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline pkosphatase，PLAP)ELISA試劑盒(Human STBM-ELIS

14、A試劑盒)檢測STBM的脫落水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛體視學(xué)參數(shù)
　　 NP組胎盤中合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛數(shù)密度、表面積密度及體積密度均高于sPE組，sPE組胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛數(shù)目明顯少于NP組(P<0.05)；且Hypoxia組胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛數(shù)目明顯少于Normoxia組(P<0.05)。
　　 2.RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ在胎盤組織中的定

15、位
　　 RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白在四組胎盤中合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和一些基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(棕黃色顆粒為陽性表達)，但主要表達在合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中。
　　 3.RhoA、RhoB、RhoC、ROCKⅠ、ROCKⅡ在胎盤組織中的表達
　　 sPE組RhoA、RhoB、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達水平高于NP組(P<0.05)；Hypoxia和Normoxia組

16、0.5h RhoA、RhoB、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達開始增多，3h增高明顯，6h升高達高峰，12 h下降，且Hypoxia組RhoA、RhoB、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達水平高于Normoxia組(P<0.05)；而RhoC蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)。
　　 4.體外胎盤絨毛組織培養(yǎng)上清液中STBM的脫落水平
　　 胎盤絨毛組織培養(yǎng)0.5h STBM脫落水平開始升高，6h達高峰，12 h開始下降，

17、且Hypoxia組明顯高于Normoxia組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過電鏡觀察及Image Pro軟件分析，發(fā)現(xiàn)sPE胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞表面微絨毛體視學(xué)參數(shù)較之正常妊娠顯著下調(diào)，同時應(yīng)用低氧條件模擬sPE發(fā)病微環(huán)境，驗證了低氧可造成STBM自合體滋養(yǎng)細(xì)胞表面脫落上調(diào)的科學(xué)假設(shè)，為“應(yīng)用外周循環(huán)STBM預(yù)測sPE發(fā)病及預(yù)后”提供了實驗依據(jù)，對sPE防治具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 2.應(yīng)用免疫印跡

18、和免疫組織化學(xué)的實驗方法，發(fā)現(xiàn)sPE胎盤組織及低氧處理的正常妊娠胎盤組織RhoA、RhoB、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達水平顯著上調(diào)，而RhoC變化無顯著差異，提示RhoA、RhoB、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白參與sPE發(fā)病時合體滋養(yǎng)細(xì)胞的病理變化及生物學(xué)功能的改變。
　　 3.應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)sPE胎盤組織及低氧處理的正常妊娠胎盤組織RhoB、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表達上調(diào)與STBM脫落上調(diào)呈正相關(guān)