內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力的調(diào)節(jié)作用及其與子癇前期的關(guān)系.pdf

1、子癇前期是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡和患病的主要原因之一，其發(fā)病機制至今仍不完全清楚。對子癇前期發(fā)病機制的研究是目前圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的熱點，已經(jīng)取得了一些進展，并形成了多種學(xué)說。胎盤缺血學(xué)說是其中最為重要的學(xué)說之一。這種學(xué)說認為，妊娠期各種原因?qū)е碌淖甜B(yǎng)細胞浸潤能力降低，使胎盤形成和植入障礙，引起子宮肌層內(nèi)螺旋小動脈的重鑄失敗，胎盤血流灌注不足，不能滿足胎兒生長發(fā)育的生理需求，出現(xiàn)胎盤缺血缺氧。隨后造成胎盤組織釋放大量毒性物質(zhì)，出現(xiàn)全身性母體

2、血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂，最終母體產(chǎn)生蛋白尿、高血壓、水腫等一系列臨床癥狀，形成子癇前期。滋養(yǎng)細胞浸潤能力受到多種因素的調(diào)節(jié)，目前認為，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達減少和細胞過度凋亡是子癇前期細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力下降的重要原因。 基質(zhì)金屬蛋白酶是一組依賴Zn的蛋白水解酶家族，幾乎水解所有的細胞外基質(zhì)。其中MMP-2和MMP-9對細胞外基質(zhì)的降解能力最強。在滋養(yǎng)細胞浸潤過程中，一系列的母體細胞和它們的基底膜以及細胞外基質(zhì)是滋養(yǎng)細胞必須穿

3、過的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)中的Ⅳ型膠原、纖維蛋白原、層粘連蛋白、彈性蛋白、巢蛋白和明膠及蛋白聚糖是MMP-2和MMP-9的底物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠相比，子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細胞MMP-2和MMP-9的表達明顯減少。 細胞凋亡也是影響細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力的重要因素。在生理功能正常的情況下，形成和維持適度的凋亡是保持細胞滋養(yǎng)細胞正常浸潤能力的基本前提。細胞過度凋亡將導(dǎo)致有浸潤能力的細胞滋養(yǎng)細胞大量減少，導(dǎo)致胎盤形成和發(fā)育障礙。研究發(fā)現(xiàn)，子癇

4、前期胎盤滋養(yǎng)細胞有過度凋亡和浸潤不足發(fā)生，并認為這與子癇前期的發(fā)病機制有關(guān)。然而，目前并不清楚子癇前期細胞滋養(yǎng)細胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達減少和過度凋亡發(fā)生的原因和機制。近年來的研究表明，內(nèi)毒素與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁，在感染發(fā)生后，可被釋放入機體。已發(fā)現(xiàn)妊娠期泌尿生殖系統(tǒng)、口腔感染是子癇前期重要的誘發(fā)因素，革蘭氏陰性細菌是引起上述感染的主要菌種，而且，F(xiàn)ass等采用內(nèi)毒素制備了大鼠的子癇前期模型。在此基礎(chǔ)上

5、，我們認為內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞的浸潤能力，即對基質(zhì)金屬蛋白酶的表達和細胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。 目的： 本文在體外實驗和臨床實驗兩個方面探討內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力的影響：通過觀察內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞凋亡和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達的調(diào)控，探討內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力的調(diào)節(jié)作用；通過檢測基質(zhì)金屬蛋白酶在子癇前期胎盤組織的表達，驗證其與子癇前期的關(guān)系。 方法： 從正常早期妊娠絨毛組織，分離細胞滋養(yǎng)細胞，并采用F

6、D無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后采用RT-PCR和免疫熒光一激光共聚交檢測內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)作用，并采用Transwell觀察細胞滋養(yǎng)細胞在內(nèi)毒素作用后浸潤能力改變；采用電鏡、Hoechst DNA染色、Western blot檢測凋亡蛋白Bcl-2、Bax和caspase-8的表達等形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法，觀察內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用；最后，通過免疫組織化學(xué)方法研究基質(zhì)金屬蛋白酶在子癇前期與正常妊娠胎盤組織的表

7、達。 結(jié)果： RT-PCR和免疫熒光一激光共聚交研究結(jié)果表明內(nèi)毒素對基質(zhì)金屬蛋白酶在細胞滋養(yǎng)細胞的表達有明顯抑制作用。經(jīng)內(nèi)毒素作用24h后MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表達明顯減少。Trranswell證實了內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞浸潤能力的抑制作用：細胞滋養(yǎng)細胞穿透Transwell基底膜的數(shù)量，對照組為143.1±18.4個；內(nèi)毒素濃度為25、50、100、200ng/ml的各實驗組分別為137.7±20.2個

8、、122.8±17.5個、78.4±19.2個、50.1±23.5個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)研究表明內(nèi)毒素對細胞滋養(yǎng)細胞有明確的凋亡誘導(dǎo)作用。在倒置顯微鏡下可見，滋養(yǎng)細胞呈單層生長，細胞呈多角形或長梭形，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透亮。經(jīng)內(nèi)毒素處理后，細胞形狀變窄，胞漿透亮度降低，顆粒感增強，部分細胞突起回縮變圓，脫落呈懸浮狀，并見細胞碎片。Hoechst染色DNA在熒光顯微鏡下觀察對照組細胞核較大，染色質(zhì)分布均

9、勻；低濃度內(nèi)毒素組見大部分均染、呈藍色的細胞核，每視野可見1-3個染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，偶見細胞核裂解；高濃度內(nèi)毒素組多見染色質(zhì)濃縮狀態(tài)，細胞核裂解，可見凋亡小體。透射電鏡觀察可見凋亡細胞細胞質(zhì)濃縮，細胞出芽，線粒體腫脹，細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、核膜裂解。Westem blot結(jié)果表明內(nèi)毒素抑制Bcl-2的表達，促進Bax和凋亡蛋白caspase-8在細胞滋養(yǎng)細胞的表達。內(nèi)毒素作用24小時后各濃度組與對照組比較，滋養(yǎng)細胞Bcl-2、Bax