腫瘤相關(guān)基因ZNF403的功能研究.pdf

1、鋅指蛋白403(zinc finger protein403，ZNF403)，又稱GGNBP2（gametogenetin binding protein2），定位于人染色體17q12～17q21.1，該區(qū)位于乳腺癌，前列腺癌和喉癌等腫瘤的遺傳易感區(qū)域內(nèi)，其GenBank序列號(hào)為NM_024835.3。ZNF403基因在生物物種進(jìn)化中高度保守。目前已知人類ZNF403基因含有兩種不同的RNA轉(zhuǎn)錄剪切本。其中一個(gè)截短型剪切本為本室李友軍等

2、采用RNA差異顯示法從喉癌組織中所鑒定獲得，稱喉癌相關(guān)基因1(Laryngeal Carcinomarelated gene1，LCRG1)，僅含有7個(gè)外顯子，編碼一個(gè)含288個(gè)氨基酸的蛋白。以往研究顯示LCRG1在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的抑瘤作用。另一個(gè)全長轉(zhuǎn)錄本，含有14個(gè)外顯子，編碼一個(gè)含696個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其編碼的蛋白目前功能尚不明確。
　　因此本研究將以探討ZNF403全長轉(zhuǎn)錄本在腫瘤細(xì)胞中的生物功能為目的，以期

3、更全面的揭示該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　本研究采用輔助依賴型腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對(duì)ZNF403進(jìn)行全面的功能缺失型研究。首先采用Cre-loxp生產(chǎn)系統(tǒng)，成功構(gòu)建生產(chǎn)了高純度高效率的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒干擾表達(dá)系統(tǒng)，在獲得特異高效的內(nèi)源性表達(dá)沉默效果后，進(jìn)一步對(duì)ZNF403表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性分析，在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖，非停泊依賴性生長和細(xì)胞遷移活性進(jìn)行探討，并在體外對(duì)其細(xì)胞增殖影響進(jìn)

4、行了驗(yàn)證。為了揭示ZNF403影響細(xì)胞增殖生長的分子機(jī)制，同時(shí)采用碘化丙碇和BrdU標(biāo)記的流式細(xì)胞分析術(shù)對(duì)ZNF403缺失在細(xì)胞周期中的影響進(jìn)行分析,并采用高通量精確的人類細(xì)胞周期RealtimePCR array,全面比較ZNF403缺失后84個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平變化，并采用Western blot對(duì)部分重要基因的蛋白水平變化進(jìn)行驗(yàn)證，以期明確ZNF403在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的角色和位置。此外，本研究還對(duì)候選ZNF40

5、3基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行了初步研究分析，成功克隆其5'-端啟動(dòng)子區(qū)域，并利用缺失突變、報(bào)告基因、轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行初步鑒定，同時(shí)采用TCDD藥物處理分析特殊轉(zhuǎn)錄因子AHR結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)控影響。本研究首次發(fā)現(xiàn)ZNF403基因?yàn)橐粋€(gè)新的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，抑制ZNF403的表達(dá)能通過阻滯細(xì)胞周期的S期和G2/M檢測(cè)點(diǎn)，顯著抑制腫瘤的增殖，為腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了有價(jià)值的線索。
　　[ZNF403基因結(jié)構(gòu)，同源性分析及在

6、腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)檢測(cè)]
　　ZNF403基因定位于腫瘤相關(guān)的遺傳易感區(qū)17q12～17q21.1.區(qū)域內(nèi)，該基因的全長轉(zhuǎn)錄本為2869 bp，含有14個(gè)外顯子，編碼序列(CDS)位置為317-2410，編碼一個(gè)包含696個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（蛋白序列登錄號(hào):Q9H3C7.1）。由于剪接方式不同目前已知形成至少2種mRNA剪接變異體，編碼至少2種不同的蛋白質(zhì)。除全長轉(zhuǎn)錄本ZNF403外，其剪切異構(gòu)轉(zhuǎn)錄本LCRG1的全長為3448bp，

7、包括7個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由288個(gè)氨基酸組成的蛋白。利用比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人ZNF403基因在黑猩猩、獼猴、狗、牛及小鼠等多種動(dòng)物中高度同源，提示該基因在進(jìn)化中的的高度保守性。本研究采用特異性引物在不同細(xì)胞株中分別對(duì)ZNF403和LCRG1的表達(dá)進(jìn)行Real timePCR檢測(cè)，結(jié)果顯示ZNF403的表達(dá)水平比LCRG1高大約10倍，而Western Blot方法僅能檢測(cè)到ZNF403蛋白的表達(dá)，以上結(jié)果說明ZNF403為該基因的主要

8、轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物。
　　[輔助依賴型腺病毒介導(dǎo)的人類ZNF403基因RNA干擾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，構(gòu)建和鑒定]
　　采用基于RNA聚合酶Ⅲ，鼠源性U6啟動(dòng)子的DNA載體構(gòu)建表達(dá)shRNA。特異性針對(duì)ZNF403的目標(biāo)序列如下:5'-GGGCAAATTCTGAAGAGAACGACA-3'。采用兩對(duì)互補(bǔ)的DNAoligos構(gòu)建一個(gè)含有U6 promoter和ZNF403 shRNA的輔助依賴型腺病毒(HD-Ad vector)質(zhì)粒形式載體H

9、D-Ad-ZNF403-shRNA。然后經(jīng)PmeI酶切該質(zhì)粒載體，暴露病毒末端倒置重復(fù)序列，再與輔助性病毒的共同感染116細(xì)胞，采用Cre/loxP系統(tǒng)進(jìn)行輔助依賴型腺病毒的生產(chǎn)。經(jīng)過拯救，擴(kuò)增和大量擴(kuò)增三大步驟后收集細(xì)胞，采用氯化銫不連續(xù)密度梯度離心及透析純化病毒，經(jīng)濃度和純度檢測(cè)得到了高濃度高純度的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒載體。
　　為檢測(cè)該載體的RNA干擾效率，采用不同濃度的HD-Ad-ZNF403-shRN

10、A和無效應(yīng)HD-Ad-shRNA-control對(duì)ZNF403表達(dá)水平高的Hep-2和HEK293細(xì)胞進(jìn)行感染，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HDAd-ZNF403-shRNA對(duì)ZNF403內(nèi)源性mRNA表達(dá)水平有顯著高效的干擾抑制效應(yīng)。50MOI為用量最小且干擾效果最明顯的載體濃度。Western blot檢測(cè)說明在50MOI時(shí)，內(nèi)源性ZNF403蛋白表達(dá)完全缺如，干擾效果好。同時(shí)結(jié)果顯示，HDAd-ZNF403-shRNA不影

11、響LCRG1的表達(dá)，證實(shí)了其RNA干擾的特異性。
　　[ZNF403表達(dá)抑制后的腫瘤生物學(xué)特性研究]
　　采用HD-Ad-ZNF403-shRNA和無效應(yīng)HD-Ad-shRNA-control對(duì)Hep-2和HEK293細(xì)胞分別進(jìn)行感染(50 MOI)，24小時(shí)后，經(jīng)過Realtime PCR驗(yàn)證其內(nèi)源性ZNF403表達(dá)抑制效果后，進(jìn)行后續(xù)腫瘤生物學(xué)功能研究實(shí)驗(yàn)。采用BrdU標(biāo)記細(xì)胞增殖Elisa方法，結(jié)果顯示ZNF403缺失

12、在體內(nèi)顯著抑制細(xì)胞增殖活動(dòng)，該結(jié)果得到了體外裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。此外，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)提示ZNF403缺失對(duì)腫瘤細(xì)胞非停泊依賴性生長有明顯損傷抑制效應(yīng);同時(shí)，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示ZNF403缺失亦對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移活動(dòng)具有抑制效應(yīng)。綜合以上研究結(jié)果，初步揭示ZNF403缺失能在體內(nèi)體外均具有抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并能顯著降低喉癌細(xì)胞的惡性表型。
　　[ZNF403在細(xì)胞周期中的作用機(jī)制研究]
　　首先采用生物信息學(xué)軟件ELM對(duì)ZN

13、F403蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，如RB LXCXEmotif, Cyclins結(jié)合位點(diǎn)，PCNA結(jié)合位點(diǎn)等，提示ZNF403可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。繼而采用碘化丙碇(PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZNF403基因表達(dá)抑制后對(duì)細(xì)胞各周期的影響。結(jié)果表明，ZNF403基因表達(dá)抑制能導(dǎo)致G2/M阻滯，并輕度影響S期的進(jìn)程。當(dāng)采用不同劑量的HD-Ad-ZNF403-shRNA的感染細(xì)胞時(shí)，Z

14、NF403的缺失導(dǎo)致的細(xì)胞周期G2/M期阻滯呈劑量相關(guān)效應(yīng)。同時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)ZNF403的缺失對(duì)細(xì)胞周期的影響為非一過性的短期細(xì)胞反應(yīng)，而是穩(wěn)定的G2/M阻滯作用。此外，BrdU標(biāo)記的動(dòng)態(tài)細(xì)胞周期進(jìn)程分析進(jìn)一步驗(yàn)證了ZNF403的缺失導(dǎo)致的G2/M期阻滯。
　　為了揭示ZNF403在細(xì)胞周期調(diào)控中的分子機(jī)制，采用高通量精確的人類細(xì)胞周期Realtime PCR array，全面比較ZNF403缺失后84個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)

15、控基因的表達(dá)水平變化，提示以P21，MCM2，ATM，MRE11A為代表的多個(gè)細(xì)胞周期基因RNA水平發(fā)生顯著改變。同時(shí)上述4個(gè)基因的表達(dá)變化在蛋白水平亦得到證實(shí)。該研究結(jié)果合理解釋了ZNF403表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，首次報(bào)道了ZNF403在細(xì)胞周期中的重要功能，并初步對(duì)其在細(xì)胞周期中的調(diào)控分子機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　[ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測(cè)，克隆，分離鑒定及其調(diào)控元件的初步分析]
　　首先利用多個(gè)生物信息學(xué)軟件

16、預(yù)測(cè)ZNF403基因CpG島及其啟動(dòng)子區(qū)域。經(jīng)在線程序CpGplot，Methprimer，F(xiàn)irstEF，Gene2 promoter和NNPP的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，并結(jié)合TSSs預(yù)測(cè)、CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果，初步認(rèn)為ZNF403基因啟動(dòng)子位于(-1465，+199)較長區(qū)間內(nèi)，并選取該1646 bp片段構(gòu)建一系列5'-或3'-端缺失的啟動(dòng)子片段熒光素酶報(bào)告基因載體，經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，雙熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果表明ZNF403基因核心啟動(dòng)子定位于(

17、-926～-682)區(qū)間。采用MatlnspectorV2.2和TESS軟件搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，顯示核心啟動(dòng)子區(qū)存在AHR，E2F1等重要調(diào)控元件，同時(shí)保守進(jìn)化足跡軟件ECR發(fā)現(xiàn)AHR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)高度保守地同時(shí)存在于小鼠的5'端調(diào)控區(qū)和人ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)。采用AHR刺激物TCDD處理細(xì)胞，并檢測(cè)啟動(dòng)子活性變化，結(jié)果顯示TCDD處理的細(xì)胞啟動(dòng)子活性上升，這表明TCDD對(duì)ZNF403的表達(dá)調(diào)控可能是通過其啟動(dòng)子區(qū)域的AHR結(jié)合