ZNF217基因在卵巢漿液性囊腺癌的表達(dá)及其相關(guān)研究.pdf

1、研究背景 在婦科腫瘤中，卵巢癌(ovariancancer)是婦科三大惡性腫瘤之一，卵巢癌尤其是上皮性卵巢癌因其缺乏完善的早期診斷方法，晚期病例療效又差，即使腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及化療等技術(shù)不斷改進(jìn)，5年生存率仍徘徊在30％左右尷尬的局面，死亡率一直高居榜首。近年來研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌有年輕化的趨勢(shì)，并且預(yù)后極度不良。所以，對(duì)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥的分子機(jī)制，完善卵巢癌的基因治療是目前研究的熱點(diǎn)之一，這對(duì)臨床上改善卵巢癌病人的預(yù)后，提高五

2、年生存率具有重要意義。 隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展常與染色體異常有關(guān)，這種非隨機(jī)性的異常包括了染色體的丟失、獲得、擴(kuò)增和重排等[1]，此時(shí)用傳統(tǒng)的研究方法不能滿足人們作進(jìn)一步的研究，轉(zhuǎn)向關(guān)注腫瘤遺傳學(xué)的發(fā)展。對(duì)于婦科惡性腫瘤來說，卵巢癌發(fā)病率位居第二位，預(yù)后極度不良，可能與病人出現(xiàn)癥狀較晚，早期癥狀不明顯，缺乏有效的檢測(cè)手段有關(guān)。目前有關(guān)卵巢癌細(xì)胞遺傳學(xué)的報(bào)道較少，一方面是因?yàn)橛嘘P(guān)卵巢癌細(xì)胞的分

3、裂指數(shù)很低，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后難以獲得足夠數(shù)目可供G帶分析的高質(zhì)量核型的中期染色體；另一方面，卵巢癌的核型極為復(fù)雜，難以得到一致的結(jié)果。而研究卵巢癌遺傳物質(zhì)的改變，對(duì)臨床的發(fā)病機(jī)理的探討、臨床分型、治療有極大的幫助。通過CGH(比較基因組雜交技術(shù))和FISH(熒光原位雜交技術(shù))發(fā)現(xiàn)卵巢癌在20q、3q、1q、8q、12p、11q和17q中獲得，在xp、18q、4q、9p、13q中發(fā)生了缺失，而以20q發(fā)生了擴(kuò)增的機(jī)率較為頻繁[2-5]。新近

4、研究亦發(fā)現(xiàn)20q13.2位點(diǎn)上常常有基因的拷貝數(shù)增加，該區(qū)域包含了ZNF217和STK15兩種腫瘤候選基因[6-7]。在20q位點(diǎn)上篩選出新的卵巢癌腫瘤基因是目前研究分子發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。 ZNF217基因定位在20q13.2，是一種鋅指蛋白，編碼為Kruppel樣的轉(zhuǎn)錄因子，好發(fā)于實(shí)體瘤中[8，9]。有研究表明，ZNF217基因可能與端粒轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)有關(guān)，端粒其實(shí)是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)構(gòu)成

5、。在穩(wěn)定染色體、防止染色體末端融合等方面有著重要作用[10]。端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核糖核酸蛋白酶，主要由端粒酶RNA(TR)，端粒酶連接蛋白(TEP1)和端粒酶催化亞單位(TERT)三種成分構(gòu)成。正常細(xì)胞不具有端粒酶活性，隨著分裂次數(shù)的增加，端粒進(jìn)行性丟失，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到一定程度就出現(xiàn)功能喪失，染色體出現(xiàn)端端融合、被酶解等各種異常形態(tài)，細(xì)胞就停止增殖，出現(xiàn)衰老和凋亡[11]。因端粒酶可以維持端粒長(zhǎng)度，故酶活化后可不斷合成端粒D

6、NA，使細(xì)胞無限制增殖而成為永生細(xì)胞[12，13]。ZNF217基因有對(duì)抗TGF-β生長(zhǎng)抑制作用，TGF-β是TGF家族成員之一，是一種二聚體多肽，對(duì)上皮細(xì)胞的增生具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，主要是通過對(duì)細(xì)胞周期G1/S阻滯作用來抑制上皮細(xì)胞的增生，抑制細(xì)胞老化，細(xì)胞呈現(xiàn)無限增值、永生化特征，促進(jìn)致瘤性轉(zhuǎn)化[14，9]，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。目前對(duì)ZNF217基因報(bào)導(dǎo)很少，對(duì)該基因的作用機(jī)制及其功能尚不清楚，故需作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加于驗(yàn)

7、證。 目的 熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一種熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交的原理在細(xì)胞核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法[15]。它可以快速、直觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)出中期核分裂相或間期核細(xì)胞中染色體數(shù)目以及結(jié)構(gòu)的異常變化[16]。本課題采用FISH從DNA水平上明確ZNF217腫瘤基因在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株、新鮮的癌組織、蠟塊組織和正常的卵巢組織中基因拷貝數(shù)改變

8、的情況。但是FISH只是在DNA水平上說明問題，對(duì)該基因有意義的片斷我們并不清楚，因此我們?cè)偻ㄟ^RT-PCR在mRNA水平上觀察ZNF217基因在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株、新鮮的癌組織、蠟塊組織、良性腫瘤和正常的卵巢組織中的表達(dá)情況，通過檢測(cè)ZNF217基因mRNA在不同分期的卵巢癌、良性腫瘤和正常的卵巢組織之間表達(dá)有無差異，推測(cè)該基因在卵巢癌20號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)改變與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系以及該基因與卵巢癌的病理分期有無關(guān)系，為驗(yàn)證該基因的

9、功能奠定了基礎(chǔ)，為提供卵巢癌早期診治將可能提供一個(gè)新的指標(biāo)和靶點(diǎn)，對(duì)臨床上改善卵巢癌病人的預(yù)后，提高五年生存率亦具有重要意義。 方法 1、對(duì)HO-8910、SKOV3、OVCa-R3三種卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株進(jìn)行熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)，應(yīng)用ZNF217探針及18號(hào)染色體著絲粒探針檢測(cè)標(biāo)本，ZNF217探針為橙紅色，18號(hào)著絲粒探針為綠色，起內(nèi)參照作用，在DNA水平上觀察ZNF217候選腫瘤基因在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株上有無

10、發(fā)生擴(kuò)增現(xiàn)象。 2、對(duì)不同分期的卵巢漿液性囊腺癌和卵巢漿液性囊腺瘤(包括新鮮組織、石蠟組織)、正常卵巢組織進(jìn)行熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)，應(yīng)用ZNF217探針及18號(hào)染色體著絲粒探針檢測(cè)標(biāo)本，了解ZNF217候選腫瘤基因在不同的卵巢組織上有無發(fā)生擴(kuò)增現(xiàn)象。 3、對(duì)卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系、新鮮組織提取總RNA，純化后通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR方法測(cè)定，在轉(zhuǎn)錄水平上觀察ZNF217

11、腫瘤基因的表達(dá)情況，并通過檢測(cè)灰度值了解ZNF217基因的表達(dá)有無增強(qiáng)。 本課題應(yīng)用pearsonx2檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)軟件：SPSS10.0)檢驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以正常卵巢組織作為陰性對(duì)照，分別設(shè)立了卵巢漿液性囊腺癌、卵巢漿液性囊腺瘤試驗(yàn)組。 結(jié)果 1、以外周血為對(duì)照組，外周血雜交信號(hào)為2個(gè)橙紅色及2個(gè)綠色(橙紅色為目的基因，綠色為內(nèi)參基因)，在HO-8910、SKOV3、OVCaR3三種卵巢癌漿液性囊腺癌細(xì)胞系中，橙紅色信

12、號(hào)數(shù)目分別5、4、3個(gè)，綠色信號(hào)均為2個(gè)，橙紅色信號(hào)數(shù)目均超過了綠色信號(hào)，這三種細(xì)胞株均發(fā)生了ZNF217基因擴(kuò)增。 2、在卵巢漿液性囊腺癌23例(其中Ⅰ期11例，Ⅲ-Ⅳ期12例)中，出現(xiàn)ZNF217基因擴(kuò)增有12例，占52.17％。其中，Ⅰ期的卵巢漿液性囊腺癌紅色雜交信號(hào)超過2個(gè)有3例(27.27％)，Ⅲ-Ⅳ期的有9例(75.00％)，卵巢漿液性囊腺瘤基本上為2個(gè)紅色熒光信號(hào)，僅有1例出現(xiàn)3個(gè)紅色雜交信號(hào)，正常卵巢組織均為2個(gè)

13、雜交信號(hào)。晚期卵巢癌與早期的ZNF217基因拷貝數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。良性腫瘤只有一例發(fā)生擴(kuò)增，可能為偶發(fā)事件，而正常的卵巢組織未發(fā)現(xiàn)有ZNF217基因擴(kuò)增，卵巢癌與卵巢良性腫瘤、正常卵巢組織比較，ZNF217基因拷貝數(shù)具有顯著性差異(P＜0.05)。 3、在RT-PCR技術(shù)檢測(cè)中，內(nèi)參GAPDH為519bp，ZNF217為252bp，目的基因相對(duì)拷貝數(shù)=目的基因電泳條帶的灰度值/GAPDH參照基因條帶的灰度值，當(dāng)兩者

14、的比值＞2時(shí)，表示ZNF217基因發(fā)生了擴(kuò)增。在23例卵巢卵巢漿液性囊腺癌中，有¨例灰度值＞2，其中早期漿液性囊腺癌占3例(27.27％)，晚期的8例(66.67％)，良性腫瘤及正常卵巢組織的灰度值＜2。卵巢癌與卵巢良性腫瘤、正常卵巢組織比較，ZNF217基因表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論 1、ZNF217候選腫瘤基因在三種卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株全部發(fā)生了擴(kuò)增，而正常人外周血細(xì)胞均未發(fā)生該基因擴(kuò)增，考慮ZNF

15、217基因與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。 2、在分化晚期的和早期卵巢漿液性囊腺癌中，ZNF217基因擴(kuò)增率分別為：75.00％、27.27％，晚期的卵巢癌比早期的ZNF217基因發(fā)生擴(kuò)增幾率明顯增加，而卵巢漿液性囊腺瘤及正常的卵巢組織中ZNF217基因未發(fā)生擴(kuò)增，所以，ZNF217基因很可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展以及卵巢癌的預(yù)后不良有關(guān)。 3、在RT-PCR中，ZNF217基因在卵巢漿液性囊腺癌組織mRNA表達(dá)水平明顯比卵巢漿液性囊腺