MicroRNA-203靶向ZNF217基因調(diào)控結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率分別占男性和女性全部惡性腫瘤的9.4％和10.1％，每年約有120萬名患者被診斷為結(jié)直腸癌，而有超過60萬名患者直接或間接死于結(jié)直腸癌。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，其發(fā)病率高居腫瘤第二位，死亡率高達(dá)33％。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平和生活水平的持續(xù)提高，飲食習(xí)慣與結(jié)構(gòu)的改變，國(guó)內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，全國(guó)每年約有新發(fā)病例13萬，近幾年國(guó)內(nèi)結(jié)直腸癌

2、發(fā)病率正以4％的速度遞增，已經(jīng)躍居我國(guó)惡性腫瘤死亡率第五位。東南沿海地帶成為結(jié)、直腸癌高發(fā)區(qū)域，發(fā)病率約為48/10萬，與西方發(fā)達(dá)國(guó)家類似，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病具有年輕化、家族聚集、遺傳易感等特征?，F(xiàn)階段結(jié)直腸癌的治療主要靠手術(shù)，但由于大部分腫瘤發(fā)現(xiàn)已經(jīng)是晚期，而且術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)、輔助治療療效不理想，都會(huì)影響病人的生存情況與治愈效果，因此，對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制需要進(jìn)行進(jìn)一步更深入的研究，以便探索更為有效的治療途徑。
　　結(jié)直腸癌與

3、其他類型腫瘤一樣，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多水平、多基因參與的過程，伴隨著復(fù)雜的基因表達(dá)失調(diào)，其中包括編碼及非編碼基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)的異常。結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制尚未闡明，早干預(yù)、早發(fā)現(xiàn)和早治療是改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后、提高患者治愈率的關(guān)鍵，深入研究結(jié)直腸癌相關(guān)基因的異常表達(dá)機(jī)制將有助于結(jié)直腸癌的預(yù)防、診斷、和治療。
　　鋅指蛋白(ZNF)217基因定位在20q13.2，是一種鋅指蛋白，編碼為Kruppel樣的轉(zhuǎn)錄因子。ZNF217做

4、為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以和CTBP1/2與組蛋白修飾酶結(jié)合相聯(lián)形成復(fù)合物，由其鋅指結(jié)構(gòu)介導(dǎo)，然后和啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)和細(xì)胞分化和器官形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制作用，ZNF217基因作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，到目前為止，一些研究結(jié)果證實(shí)ZNF217在乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中表達(dá)上升，而且在乳腺癌和卵巢癌中已經(jīng)證實(shí)ZNF217與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，在結(jié)直腸癌中，ZNF217表達(dá)水平增高，但與病人的病理特點(diǎn)、病人的預(yù)

5、后之間的相關(guān)性，目前少有報(bào)道，同時(shí)闡明ZNF217通過什么途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可為腫瘤的靶向治療提供新的位點(diǎn)，具有極其重要的意義，這進(jìn)一步促使我們研究ZNF217在結(jié)直腸腫瘤環(huán)境中參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)生的，長(zhǎng)度約16-24個(gè)核苷酸的小RNA分子，是當(dāng)前處在研究熱點(diǎn)的非編碼RNA，它能夠與mRNA的種子序列配對(duì)結(jié)合，從而抑制其靶基因表達(dá)，是在位置和序列上都比較保守的

6、一類基因。microRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過程中起多種作用，可以精密調(diào)節(jié)基因的蛋白合成，能夠與靶mRNAs3'端非編碼區(qū)域(3'-UTR)相結(jié)合，使靶基因mRNA降解或沉默從而阻止其迸一步的翻譯表達(dá)。目前，microRNA被認(rèn)為是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的因子，microRNA能夠同時(shí)靶向多個(gè)基因，眾多的microRNA分子和它們所調(diào)控的靶基因在體內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞惡性生物學(xué)行為改變。基因組的不穩(wěn)定是腫瘤細(xì)

7、胞的一個(gè)重要特征，所以癌組織的基因表達(dá)和同一分化來源的正常組織的基因表達(dá)明顯不一樣，約50％的microRNA基因分布于染色質(zhì)斷裂位點(diǎn)和脆性位點(diǎn)，這些部位屬于基因組不穩(wěn)定部位，因此在不同類型腫瘤中發(fā)生的改變也有很大差異。有的miRNA起到癌基因的作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的惡化，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移，有的miRNA則起著抑癌基因的作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管形成。microRNA-203(miR-203)是一個(gè)首先在皮

8、膚細(xì)胞中鑒定出來的小分子，miR-203基因序列定位于人類染色體14q32上，該區(qū)域是不穩(wěn)定區(qū)域，含有52種miRNA的基因序列，編碼人類已知約12％的miRNA，成熟的miR-203由22個(gè)核苷酸組成，廣泛分布于人體各種組織器官，但具有組織分布差異性，是一種皮膚特異性miRNA。研究表明，miR-203啟動(dòng)子甲基化或其他原因可引起大量靶基因如SNAI2、BMI-1、KLF4等表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，miR-203已經(jīng)被證實(shí)在多種

9、腫瘤組織中異常表達(dá)，如乳腺癌，膀胱癌，前列腺癌，胰腺癌，肝癌，血液系統(tǒng)腫瘤，食管癌，喉癌等，且在這些腫瘤組織中其含量與正常組織相比具有顯著地差異。miR-203的異常表達(dá)可以影響腫瘤的增殖、凋亡、血管浸潤(rùn)，及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，Yuan Y等在人食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究表明miR-203可以通過調(diào)節(jié)ΔNp63介導(dǎo)的細(xì)胞通路起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用。迄今為止，有關(guān)miR-203在結(jié)直腸癌中表達(dá)的研究報(bào)道較少，本研究旨在揭示結(jié)直腸癌中

10、miR-203的表達(dá)情況，研究其對(duì)ZNF217基因的調(diào)控機(jī)制及對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　第一部分
　　ZNF217在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與microRNA-203表達(dá)的相關(guān)性
　　研究目的：
　　1.檢測(cè)并分析ZNF217在結(jié)直腸癌組織與相應(yīng)正常癌旁組織中是否存在差異表達(dá)。
　　2.分析ZNF217的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小、病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

11、、及臨床分期之間的關(guān)系。
　　3.分析ZNF217在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　4.檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中miR-203的表達(dá)水平，并分析其與ZNF217的表達(dá)是否具有相關(guān)性。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ZNF217在82例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)，并分析腫瘤組織中ZNF217表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特點(diǎn)、與預(yù)后之間的關(guān)系。
　　2.qRT-PCR方法

12、檢測(cè)ZNF217mRNA水平和miR-203在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并用Pearson相關(guān)分析法分析腫瘤組織中ZNF217與miR-203表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，ZNF217在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織（P＜0.05）。
　　2.ZNF217的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者腫瘤大?。≒=0.042）、浸潤(rùn)深度(P=0.03)及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.01）相關(guān)，而與年齡、性

13、別、分化程度、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移與臨床分期無顯著相關(guān)性（P＞0.05）;ZNF217表達(dá)水平高的腫瘤患者5年總體生存率低于ZNF217表達(dá)水平低的患者（P=0.028）。
　　3.Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，結(jié)直腸癌腫瘤組織中的ZNF217相對(duì)表達(dá)量miR-203的相對(duì)表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)(Pearson correlation=0.7431，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.ZNF217在結(jié)直腸癌癌腫瘤組織較相應(yīng)癌旁組

14、織表達(dá)增高，其表達(dá)水平與腫瘤組織的腫瘤大小、浸潤(rùn)深度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，ZNF217可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　2.ZNF217的表達(dá)與miR-203的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者可能共同參與了結(jié)直腸癌的發(fā)病過程。
　　第二部分
　　ZNF217對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　研究目的：
　　研究ZNF217在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，遷移、侵襲中的作用。
　　研究方法：
　

15、　1.通過脂質(zhì)體Lipofect2000將siRNA-ZNF217及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞中，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　2.采用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的變化;Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化，探討ZNF217在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。
　　結(jié)果：
　　與轉(zhuǎn)染siRNA-negative control的對(duì)照組細(xì)胞相比，siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)

16、染組的細(xì)胞ZNF217表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱。
　　結(jié)論：
　　ZNF217基因表達(dá)下降能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　第三部分
　　miR-203調(diào)控結(jié)直腸癌ZNF217基因的研究
　　研究目的：
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ZNF217的上游microRNA調(diào)節(jié)基因，并驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系。
　　2.結(jié)直腸癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-203 mimics、miR

17、-203 inhibitor，探討miR-203異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　3.探討ZNF217，miR-203聯(lián)合異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　研究方法：
　　1.利用脂質(zhì)體Lipofect2000分別將miR-203 mimics、miR-203 inhibitor和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞中，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　2.采用M

18、TT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的變化;Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖遷移和侵襲能力的變化。
　　3.利用生物信息學(xué)分析軟件TargetScan和micrornaorg預(yù)測(cè)ZNF217的可能上游調(diào)節(jié)基因?yàn)閙iR-203;運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，將含有ZNF217基因3'端非編碼區(qū)序列(WT-ZNF2173'-UTR)或突變序列(MUT-ZNF2173'-UTR)的熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-203

19、mimics或miR-negative control共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，檢測(cè)各組熒光素酶的活性，驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果;結(jié)直腸癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-203 mimics，miR-negative control，利用qRT-PCR和Westemblot方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　4.將miR-203 mimics或miR-negative control與ZNF217-siRNA共轉(zhuǎn)染到結(jié)直

20、腸癌細(xì)胞系中，然后采用MTT、Transwell法遷檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的變化，探討ZNF217聯(lián)合miR-203影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.miR-203表達(dá)增高能夠降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力，反之則引起結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　2.生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ZNF217的3'-UTR區(qū)含有可與miR-203互補(bǔ)結(jié)合

21、的序列;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，人胚腎293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-203 mimics與含WT-ZNF2173'-UTR的熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，細(xì)胞的熒光素酶活性明顯下降，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);在轉(zhuǎn)染miR-203mimics的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，ZNF217的mRNA及蛋白水平均顯著下降(P＜0.05)。
　　3.和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217的結(jié)直腸癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-203 mimics的結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、

22、遷移與侵襲能力均減弱，而聯(lián)合轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217和miR-203 mimics與獨(dú)自轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF217的結(jié)直腸癌細(xì)胞或獨(dú)自轉(zhuǎn)染miR-203 mimics細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力均顯著減弱，二者具有一定的協(xié)同作用。
　　結(jié)論：
　　1.miR-203的表達(dá)水平降低能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、而miR-203的表達(dá)水平升高能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
　　2.miR-203