癌基因DEK對(duì)結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的影響及其臨床意義.pdf

1、研究背景：結(jié)直腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一，根治術(shù)后5年生存率約65％。已知增殖和轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因，因此，明確結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制、尋找能夠有效評(píng)估患者預(yù)后的分子標(biāo)志物是延長(zhǎng)結(jié)直腸癌患者生存期的關(guān)鍵。
　　癌基因DEK是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)因子，位于染色體6p22.3，為高度保守的可磷酸化的核蛋白，由位于核常染色質(zhì)的375個(gè)氨基酸組成，優(yōu)先表達(dá)于增殖活躍的惡性細(xì)胞，在每個(gè)核內(nèi)可以達(dá)到400到600萬拷貝量，是一

2、種可以影響細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、抑制細(xì)胞分化、老化和凋亡以及轉(zhuǎn)化的致癌基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，癌基因DEK在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要的促癌作用，可以作為乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的增殖檢測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，但在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制尚不清楚。
　　研究目的：本研究通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究癌基因DEK對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，初步探討DEK基因參與結(jié)腸癌演進(jìn)的分子機(jī)制；進(jìn)而通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DEK基因?qū)Y(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值，為結(jié)直腸癌提供有效

3、的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。
　　材料和方法：
　　1.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分：通過RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)DE K在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480和SW620中的表達(dá)，并通過免疫熒光對(duì)siControl-和siDEK-SW620細(xì)胞進(jìn)行染色，在共聚焦顯微鏡下觀察DEK蛋白在SW620細(xì)胞中的定位。經(jīng)siDEK轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，進(jìn)行MTT、細(xì)胞分子克隆等功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DEK沉默后細(xì)胞

4、增殖能力的變化；利用Hoechst33342細(xì)胞核染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DEK基因沉默后細(xì)胞凋亡水平的變化；再通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DEK沉默后SW620細(xì)胞遷移能力的影響；通過Western blot方法檢測(cè)DEK沉默對(duì)SW620細(xì)胞中增殖、凋亡及遷移相關(guān)因子的變化；
　　2.組織學(xué)實(shí)驗(yàn)部分：利用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)術(shù)后4例新鮮結(jié)直腸癌及其癌旁組織中DEK基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)；免疫組化方法對(duì)109例術(shù)后

5、結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織、52例結(jié)直腸腺瘤組織蠟塊進(jìn)行DEK蛋白的檢測(cè)，比較DEK蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，并通過生存分析驗(yàn)證DEK蛋白表達(dá)對(duì)臨床患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分：RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，結(jié)直腸細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中均有DEK mRNA和蛋白的表達(dá)；免疫熒光染色表明DE K基因主要表達(dá)于SW620細(xì)胞核；MTT及細(xì)胞克

6、隆實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)DEK基因沉默后（siDEK濃度為100nM），SW620細(xì)胞的增殖能力明顯下降；Hoechst33342染色顯示DEK基因沉默后（siDEK濃度為100nM），凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siDEK主要促進(jìn)細(xì)胞的早期凋亡；劃痕實(shí)驗(yàn)表明siDEK（100nM）轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞的遷移能力明顯下降；最后Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DEK會(huì)上調(diào)mutant-p53、MDM2和PARP的表達(dá)和Bcl

7、-2/Bax的比率、抑制caspase-3和caspase-9的活性，并通過抑制E-cadherin及β-catenin的活性而增加其轉(zhuǎn)移侵襲能力；
　　2.組織學(xué)實(shí)驗(yàn)部分：新鮮結(jié)直腸癌組織RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，DEK的mRNA和蛋白水平均明顯高于正常組織；免疫組化結(jié)果表明，DEK蛋白在結(jié)直腸癌中的陽性率（97.2%）和強(qiáng)陽性率（48.6%）也均明顯高于周圍正常結(jié)直腸粘膜組織（陽性率33.0%，強(qiáng)陽性率9

8、.2%）及良性腺瘤組織（陽性率32.7%，強(qiáng)陽性率13.5%），并與患者腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤(rùn)以及分期等臨床病理學(xué)特點(diǎn)密切相關(guān)；生存分析發(fā)現(xiàn)，DEK高表達(dá)患者的無瘤生存率及5年生存率均低于DEK低表達(dá)者；DEK表達(dá)聯(lián)合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵潤(rùn)、病理分期和CEA水平共同影響總生存率；DEK蛋白高表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。
　　結(jié)論：DEK高表達(dá)于結(jié)腸癌的細(xì)胞及組織中；DEK促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、平板克隆形成