Wip1在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞凋亡、侵襲中的作用及相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，也是導(dǎo)致女性死亡的常見(jiàn)的惡性腫瘤。由于卵巢癌早期癥狀不典型，絕大多數(shù)患有卵巢癌的女性發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，腫瘤已擴(kuò)散至卵巢以外的器官，卵巢癌的5年生存率只有30-40％。盡管手術(shù)和化療方案不斷改進(jìn)，但是大多數(shù)患者往往會(huì)復(fù)發(fā)，預(yù)后很差。因此，卵巢癌嚴(yán)重威脅著廣大女性的身體健康。目前關(guān)于卵巢癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚。細(xì)胞凋亡是人體內(nèi)細(xì)胞死亡的主要途徑之一，其過(guò)程受機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控，調(diào)控失衡可引起細(xì)胞異常

2、增殖或異常凋亡，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。
　　研究表明，卵巢癌細(xì)胞凋亡異常是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。野生型p53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1（Wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1）是1997年發(fā)現(xiàn)的一種依賴于p53的原癌基因，它廣泛參與調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路，對(duì)卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生起重要作用。Wip1是一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由PPM1D(Protein phasphatase magnes

3、ium-dependent1 delta)基因編碼，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，位于人染色體17q23/q24區(qū)域,是PP2C（protein phosatase type2C）家族中的一員。研究顯示W(wǎng)ip1基因與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。有研究將大鼠暴露于錳環(huán)境中造成神經(jīng)壞死并制成大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加而神經(jīng)組織及細(xì)胞中Wip1的表達(dá)量則顯著下降。還有研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌和腎癌組織中Wip1的表達(dá)水平均顯著高于其正常組織，沉默Wip1

4、后兩種癌細(xì)胞的凋亡明顯增加。在HeLa細(xì)胞中，沉默Wip1顯著降低細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而細(xì)胞凋亡增加，p-p38 MAPK、p-p53、p53蛋白的表達(dá)也顯著增加。因此，Wip1參與了抑制癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程。Wip1表達(dá)升高具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Wip1在乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤組織存在高表達(dá)，提示W(wǎng)ip1與惡性腫瘤的關(guān)系密切。
　　關(guān)于Wip1在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

5、因此，本課題通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法、Real-Time PCR、Western blot方法觀察Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，采用小干擾RNA技術(shù)、Real-Time PCR、Western blot、Transwell等技術(shù)研究Wip1對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡、侵襲的影響，以闡明Wip1在卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。
　　第一部分：Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)及意

6、義
　　目的：探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況以及Wip1與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：選取2012年9月至2014年12月期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科手術(shù)經(jīng)病理檢查確診的患者標(biāo)本80例為研究對(duì)象，其中卵巢漿液性囊腺癌50例,交界性卵巢漿液性囊腺瘤20例和因子宮肌瘤行全子宮+雙側(cè)附件切除術(shù)且病理證實(shí)為正常卵巢組織10例?；颊吣挲g45-67歲之間，中位年齡57歲，所有病例

7、術(shù)前無(wú)化療及放療史。按FIGO(2014)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)病理分期：Ⅰ、Ⅱ期20例，Ⅲ、Ⅳ期30例；組織學(xué)分級(jí)按照WHO標(biāo)準(zhǔn)：高分化、中分化、低分化分別為21例、7例和22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)轉(zhuǎn)移20例。標(biāo)本取材后部分置于-196℃液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱內(nèi)保存，部分標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組化染色。
　　通過(guò)免疫組化技術(shù), RT-PCR及Western blot對(duì)卵巢漿液性囊腺癌組織中的Wip1的表達(dá)進(jìn)行研

8、究,并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析,以探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)情況及其與卵巢漿液性囊腺癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理分化程度的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)
　　Wip1表達(dá)于卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞的胞核及胞漿，在卵巢漿液性囊腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為68%，在交界性卵巢漿液性囊腺瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為60%，在正常卵巢上皮細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（確切概率法P=0.001)。
　　2、 RT-PCR檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)
　　Wip1mRNA表達(dá)在卵巢漿液性囊腺癌（3.1±0.19）高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在交界性卵巢漿液性囊腺瘤（2.5±0.23）較正常卵巢組織增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3、 West

10、ern blot檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)
　　Wip1蛋白表達(dá)在卵巢漿液性囊腺癌（0.81±0.15）高于正常卵巢組織（0.45±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在交界性卵巢漿液性囊腺瘤（0.82±0.19）高于正常卵巢組織（0.45±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4、 Wip1表

11、達(dá)與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關(guān)系
　　4.1、 Wip1表達(dá)與臨床病理分期的關(guān)系
　　分為Ⅰ、Ⅱ期組及Ⅲ、Ⅳ期組兩組，Wip1在兩組卵巢漿液性囊腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為50%及80%，隨著臨床期別的升高Wip1的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.963，P=0.026）。
　　4.2、 Wip1表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系
　　Wip1在高分化、中分化、低分化卵巢漿液性囊腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)

12、率分別為52.38%、71.43%及81.82%，三組比較陽(yáng)性表達(dá)率呈增高趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(確切概率法P=0.118)。
　　4.3、 Wip1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　Wip1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Wip1陽(yáng)性表達(dá)率為45%，兩組比較有顯著性差異(χ2=8.104, P=0.004)。
　　小結(jié)：Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)密

13、切相關(guān)。表明Wip1參與了卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù)。
　　第二部分：Wip1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)、篩選與沉默
　　目的：探討Wip1在不同卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，篩選出Wip1強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究Wip1在卵巢癌細(xì)胞系中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測(cè)正常卵巢上皮細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、CAOV3

14、、A2780、ES2中Wip1mRNA及蛋白的表達(dá)。最終篩選出SKOV3作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。
　　在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中沉默Wip基因觀察其生物學(xué)行為的變化。在體外合成Wip1特異性的三對(duì)siRNA（Wip1-siRNA-1、Wip1-siRNA-2、Wip1-siRNA-3）,一對(duì)siRNA陰性對(duì)照。Lipofectamine2000介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）Control組（SKOV3細(xì)胞組）（2）

15、 N-siRNA組：轉(zhuǎn)染陰性siRNA（3）實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-siRNA（1、2、3）者。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化，并選擇出最有效的Wip1-siRNA-2做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照操作步驟每組設(shè)置好相應(yīng)平行孔,將各組細(xì)胞依次分別接種至96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別于轉(zhuǎn)染后0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí) Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化；選用siRNA的濃度分別是20nmo

16、l/L，40nmol/L，80nmol/L時(shí)作用SKOV3細(xì)胞，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化,篩選出Wip1-siRNA-2作用的最佳時(shí)間（48h）及Wip1-siRNA-2作用的最佳濃度（80nmol/L）。
　　結(jié)果：
　　1、 Real-time PCR檢測(cè)卵巢正常上皮細(xì)胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細(xì)胞株中Wip1mRNA表達(dá)
　　Wip1mRNA表達(dá)在SKOV3細(xì)胞

17、中（3.85±0.23）明顯高于正常上皮細(xì)胞，有顯著性差異（P<0.01），在CAOV3（1.73±0.46）、A2780（1.89±0.28）、ES2（1.81±0.19）細(xì)胞中也均高于卵巢正常上皮細(xì)胞，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2、 Western blot檢測(cè)卵巢正常上皮細(xì)胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細(xì)胞株中Wip1蛋白的表達(dá)
　　Wip1蛋白表達(dá)在SKOV3（0.73±0.09）、A278

18、0（0.54±0.039）、ES2（1.17±0.08）細(xì)胞中明顯高于正常上皮細(xì)胞（0.15±0.038），有顯著性差異（P<0.01），在CAOV3（0.25±0.045）細(xì)胞中也高于卵巢正常上皮細(xì)胞，有顯著性差異（P<0.05）。
　　通過(guò)檢測(cè)SKOV3、CAOV3、AZ780、ES2細(xì)胞中Wip1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wip1在SKOV3細(xì)胞中mRNA與蛋白的表達(dá)明顯高于其他三種細(xì)胞，因此后續(xù)采用SKOV3細(xì)胞進(jìn)一步研究Wip1與卵巢

19、漿液性囊腺癌的關(guān)系。
　　3、沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞的影響
　　轉(zhuǎn)染siRNA-2的SKOV3細(xì)胞中Wip1蛋白表達(dá)最少，Wip1-siRNA-2轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，Wip1的表達(dá)隨著其濃度的增加呈減少趨勢(shì)，在濃度為80nmol/L達(dá)到最低值；而作用時(shí)間為48小時(shí)Wip1蛋白表達(dá)也達(dá)到最低。提示， Wip1-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞在特定濃度和作用時(shí)間時(shí)影響最大（P<0.01）。
　　小結(jié)：在SKOV3、C

20、AOV3、A2780、ES2細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Wip1有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，其在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)水平最高，Wip1-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞在特定濃度和作用時(shí)間時(shí)沉默效果最好，為進(jìn)一步闡述其分子機(jī)制提供了理論支持。
　　第三部分：沉默Wip1對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:探討沉默Wip1對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法：AnnexinⅤ/PI染色檢測(cè)Control組、N-siRNA組、Wip

21、1-siRNA（2）（Wip1-siRNA）組中SKOV3細(xì)胞凋亡率。RT-PCR檢測(cè)Control組、N-siRNA組、Wip1-siRNA組中Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2mRNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)Control組、N-siRNA組、Wip1-siRNA組中Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、p38 MAPK、p-p

22、38MAPK、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)。為明確p38 MAPK信號(hào)通路是否參與了SKOV3細(xì)胞凋亡，加入P38 MAPK特異性抑制劑SB203580后檢測(cè)p-p38及p38的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響
　　AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果表明，與Control組相比，Wip1-siRNA組沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<

23、0.01）；與N-siRNA組相比， Wip1-siRNA組SKOV3細(xì)胞凋亡率也顯著增加（P<0.01）。此外， N-siRNA組與Control組相比SKOV3細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2、 RT-PCR檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　為研究沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡發(fā)生情況，對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-

24、3、P53、Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，沉默Wip1后，SKOV3細(xì)胞中P53mRNA（2.5±0.034）較Control組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果提示：沉默Wip1后能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。
　　3、 Western blot檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞

25、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　為研究沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡發(fā)生情況，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，沉默Wip1后，SKOV3細(xì)胞中P53蛋白（1.02±0.039）較Control組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01）；Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高，差異有統(tǒng)

26、計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果提示：沉默Wip1后能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。
　　4、沉默Wip1通過(guò) p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡
　　沉默Wip1后檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38的蛋白表達(dá)， P-P38的蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），提示P-P38可能參與了SKOV3細(xì)胞的凋亡。為明確p38 MAPK信號(hào)通路是否參與了SKOV3

27、細(xì)胞的凋亡，加入P38MAPK的特異性抑制劑SB203580，p-p38的蛋白表達(dá)則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　小結(jié)：沉默Wip1能夠促進(jìn)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)上調(diào)P53、cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比率，活化P38MAPK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　第四部分：沉默Wip1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響
　　目的：探討Wip1與卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵

28、襲力的關(guān)系，揭示W(wǎng)ip1對(duì)SKOV3細(xì)胞的侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法：劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室法測(cè)定Wip1沉默后SKOV3細(xì)胞體外侵襲能力。RT-PCR檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1、劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定Wip1-siRN

29、A沉默Wip1基因?qū)KOV3細(xì)胞體外侵襲能力的影響
　　Wip1-siRNA組細(xì)胞遷移距離（30.333±3.670）明顯短于Control組（59.333±7.685）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01）；N-siRNA組和Control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2、 Transwell小室法測(cè)定Wip1-siRNA沉默Wip1基因?qū)KOV3細(xì)胞體外侵襲能力的影響
　　Wip1-siRNA轉(zhuǎn)染S

30、KOV3細(xì)胞后使其侵襲基底膜能力受到顯著抑制， SKOV3細(xì)胞侵襲到 Transwell小室濾膜下細(xì)胞數(shù) Wip1-siRNA組為（17.167±1.835），顯著低于Control組（31.167±3.43）和 N-siRNA組（29.667±4.179），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01）；N-siRNA組和Control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、 RT-PCR檢測(cè)沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞中MMP-2

31、、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達(dá)
　　Wip1-siRNA組 MMP-2mRNA（0.51±0.013）和 MMP-9 mRNA（0.4±0.028）的表達(dá)較Control組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Wip1-siRNA組TIMP-1mRNA（0.98±0.015）和TIMP-2 mRNA（0.97±0.029）的表達(dá)較Control組無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）。
　

32、　4、 Western blot檢測(cè)沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)
　　Wip1-siRNA組MMP-2蛋白（0.43±0.049）和MMP-9蛋白（0.31±0.052）的表達(dá)較Control組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01）；Wip1-siRNA組TIMP-1蛋白（0.9±0.033）和TIMP-2蛋白（0.8±0.039）的表達(dá)較Control組無(wú)明顯改變