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文檔簡介
1、研究目的: 根據(jù)我國居民日常飲食中常見的兩種硫的衍生物(SulfuricDerivatives,SD)——硫代硫酸鈉(SodiumThiosulfate,STS)和亞硫酸氫鈉(SodiumBisulfite,SOB),利用模式動物斑馬魚對這兩種化學(xué)物質(zhì)是否存在致畸效應(yīng)進行系統(tǒng)評價,并對其致畸作用的分子基礎(chǔ)進行初步研究,為我國孕婦硫的衍生物發(fā)育暴露危險度評價工作的開展,降低因食品含硫化合物導(dǎo)致的生育風(fēng)險提供基礎(chǔ)。 研究方法
2、: 1.采用不同濃度的硫代硫酸鈉和亞硫酸氫鈉進行斑馬魚胚胎暴露處理,觀測斑馬魚的心率、循環(huán)等指標,計算發(fā)育畸形指數(shù)(developmentalmalformationindex,DMI);通過整體胚胎免疫染色,分別檢測STS或SOB暴露后胚胎的運動神經(jīng)元功能,神經(jīng)元的增殖狀態(tài)及胚胎的細胞凋亡情況;WesternBlot檢測α-Tubulin、PCNA、Bcl—2和Bax的蛋白表達水平。 2.采用原位雜交技術(shù),檢測斑馬魚胚
3、胎暴露于STS或SOB后miRNAs的表達水平,初步確定STS和SOB致畸作用的候選靶miRNAs。 3.通過顯微注射技術(shù)對候選靶miRNA進行過表達和敲低的實驗,觀測斑馬魚的發(fā)育畸形效應(yīng),以及運動神經(jīng)元功能和神經(jīng)元的增殖狀態(tài),初步對候選靶miRNAs進行功能鑒定。 結(jié)果: 1.1×10-7mol/LSOB處理組表現(xiàn)出多系統(tǒng)的發(fā)育畸形,24小時(hourspostfertilization,hpf)的胚胎,與對照
4、組相比體長略有增加、腸區(qū)出現(xiàn)明顯水腫,在48hpf和96hpf則出現(xiàn)明顯的畸形。 2.1×10-1~1mol/LSTS暴露處理的胚胎有嚴重的發(fā)育遲滯,多器官發(fā)育畸形,血流緩慢和局限性出血;1×10-4mol/L~1×10-2mol/LSTS暴露處理表現(xiàn)出心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育畸形。在胚胎暴露處理至24hpf時,觀察體軸和器官與對照組相比無明顯差異,而在48hpf和96hpf則出現(xiàn)明顯的畸形。 3.計算斑馬魚胚胎的死亡
5、率和畸形率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受精后SOB或STS暴露的斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率隨暴露時間的增長和暴露劑量的增加而增加。 4.α-Tubulin、PCNA、Bcl—2和Bax整體胚胎免疫染色和免疫印跡結(jié)果顯示:SOB處理組在胚胎發(fā)育至24hpf時α-Tubulin蛋白和PCNA蛋白表達比對照組均顯著降低;48hpf時α-Tubulin蛋白表達顯著降低,PCNA蛋白表達降低并有定位改變;96hpfα-Tubulin蛋白表達顯著降低且有定
6、位改變,PCNA蛋白表達顯著降低;Bcl—2蛋白表達顯著降低,并有定位改變;Bax蛋白表達顯著降低。STS處理組在胚胎發(fā)育至48hpf時α-Tubulin蛋白表達比對照組顯著降低;PCNA蛋白表達在胚胎發(fā)育至48hpf時顯著增高,有表達定位改變;而在發(fā)育至96hpf時,α-Tubulin和PCNA蛋白表達顯著降低且均有表達定位改變;Bcl—2蛋白表達顯著降低,并有定位改變;Bax蛋白表達顯著降低并有定位改變。 5.利用LNA修飾
7、的miRNAs探針行胚胎整體原位雜交顯示,當斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)和軟骨骨骼組織暴露于1×10-3mol/LSTS中,可誘導(dǎo)miR—124表達降低,而心肌組織中miR—133a和miR—1表達與對照組無明顯差異;暴露于1×10-7mol/LSOB中,可誘導(dǎo)miR—124表達降低,但不如1×10-3mol/LSTS的作用顯著,心肌組織中miR—133a表達降低而miR—1表達增加。 6.通過顯微注射對候選靶miR—124進行過表達,發(fā)
8、現(xiàn)在24hpf斑馬魚出現(xiàn)體短、尾卷曲以及頭部分化異常等畸形,而敲低miR—124則無明顯異常;對另一miRNAmiR—125進行過表達,發(fā)現(xiàn)在48hpf斑馬魚出現(xiàn)尾部椎管膨大畸形,而小劑量敲低miR—125則無明顯異常。同時過表達miR—124和miR—125,發(fā)現(xiàn)在24hpf斑馬魚胚胎出現(xiàn)了小頭、體短、軟骨發(fā)育不良、心包擴大,在過表達miR—124和miR—125后敲低miR—124水平,發(fā)現(xiàn)胚胎除有體短、心包擴大外,還出現(xiàn)尾部向軀體
9、一側(cè)卷折。 結(jié)論: 1.STS和SOB對斑馬魚胚胎發(fā)育具有致畸作用和劑量依賴效應(yīng),其中斑馬魚胚胎在高劑量暴露時主要表現(xiàn)為胚胎死亡,而低劑量暴露時則主要表現(xiàn)為胚胎發(fā)育畸形;STS低劑量暴露主要影響胚胎發(fā)育后期的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及頜面部形態(tài)發(fā)生與分化,SOB低劑量暴露主要影響胚胎發(fā)育早期神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、頜面部及腸區(qū)的形態(tài)發(fā)生與分化,由此推測,硫的衍生物在體內(nèi)的代謝殘留物可能通過抑制細胞周期影響神經(jīng)細胞的增殖分化。
10、 2.神經(jīng)系統(tǒng)miRNAs表達降低是硫的衍生物誘發(fā)斑馬魚胚胎畸形過程中的一個重要分子事件,而miRNAs與其靶基因或?qū)ζ浒谢蛏嫌螀^(qū)之間的相互作用可能是其致畸的一種分子機制。 3.miR—124過表達產(chǎn)生的斑馬魚胚胎腹側(cè)脊髓分化異常以及后腦分化異常,可能與異位表達miR—124有關(guān)。 4.miR—125過表達產(chǎn)生的斑馬魚尾部椎管膨隆,可能與尾部異位表達miR—125有關(guān)。 5.miR—124和miR—125
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