斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)診斷百草枯的生物毒性研究.pdf

1、近年來(lái)，除草劑大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及環(huán)境綠化，與人類接觸廣泛，其對(duì)人類健康的影響逐漸受到重視。百草枯為目前應(yīng)用較為廣泛的一類除草劑。隨著其日益推廣使用，百草枯中毒事件呈逐年上升趨勢(shì)，中毒的病死率較高，治療也異常的困難。鑒于農(nóng)田施用的大部分除草劑最終都進(jìn)入自然水體，這無(wú)疑也會(huì)對(duì)水生環(huán)境造成影響。而且目前百草枯所應(yīng)用的提取及檢測(cè)方法，樣品處理較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不宜推廣使用。因此，研究百草枯的生物毒性，建立簡(jiǎn)便、靈敏、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)方法即顯得尤為重要。本

2、文建立了離子對(duì)高效液相色譜法和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定植物中的百草枯，并通過(guò)研究百草枯與DNA的相互作用、百草枯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的生態(tài)毒性診斷研究，來(lái)評(píng)價(jià)百草枯對(duì)生物體健康的影響。
　　 目的：
　　 1.建立植物中百草枯簡(jiǎn)便、靈敏的高效液相色譜分析方法，考察冰箱中及自然環(huán)境兩種條件下菠菜中百草枯的代謝情況。
　　 2.建立測(cè)定百草枯的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新方法。
　　 3.研究百草枯與DNA之間的相互作用模式

3、。
　　 4.觀察百草枯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育各階段毒理學(xué)終點(diǎn)的影響，初步探討百草枯對(duì)水生生物的毒性。
　　 方法：
　　 1.樣品中加入甲醇/pH4-5的鹽酸水溶液（1：1），浸泡過(guò)夜后經(jīng)超聲提取，再用C18固相柱萃取百草枯，離子對(duì)反相液相色譜法對(duì)植物中的百草枯進(jìn)行分析，流動(dòng)相為0.18mol/L磷酸緩沖液含18mmol己烷磺酸鈉：乙腈=9：1，用二乙胺調(diào)節(jié)pH=2，檢測(cè)波長(zhǎng)為256nm。在菠菜中添加百草枯后分別放置

4、于冰箱和自然環(huán)境中，添加濃度分別為10.0μg/ml和100.0μg/ml，于24h、48h、72h觀察百草枯的代謝情況。
　　 2.在堿性條件下，Ag（Ⅲ）可以氧化魯米諾產(chǎn)生穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，百草枯能增強(qiáng)魯米諾-Ag（Ⅲ）體系的化學(xué)發(fā)光作用，且發(fā)光強(qiáng)度與百草枯的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。取10.0g樣品于250ml燒杯中，用100ml蒸餾水洗滌并浸泡1h后在超聲波清洗器中處理15min，取洗滌液進(jìn)樣測(cè)定。
　　

5、 3.采用紫外分光光度法、熒光分光光度法觀察了不同濃度百草枯對(duì)NR-ctDNA體系的紫外光譜、熒光光譜的影響，同時(shí)研究了離子強(qiáng)度對(duì)百草枯-DNA混合體系的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Stern-Volmer方程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
　　 4.用不同濃度的百草枯對(duì)受精后0小時(shí)的斑馬魚胚胎進(jìn)行染毒，觀察染毒后4、8、12、16、24、36、48、72小時(shí)不同的毒理學(xué)終點(diǎn)，并用LD50統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各個(gè)終點(diǎn)的EC50值。
　　 結(jié)果：
　

6、　 1.建立了植物中百草枯簡(jiǎn)便、靈敏的高效液相色譜分析方法，該方法的最低檢出限為10ng/ml（s/n=3），標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=1.21×104X+8.46×102，其相關(guān)系數(shù)r=0.9997，加標(biāo)回收率為82.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.58％。冰箱中的百草枯48h的代謝率為46.5％，自然環(huán)境下百草枯48h的代謝率為81.0％。
　　 2.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定百草枯的最低檢出限為3.4×10-6mol/L。線性范圍為1

7、.0×10-5-1.0×10-3mol/L，回歸方程為△I=2.95×107C+3.76×102，相關(guān)系數(shù)r=0.997。對(duì)2.0×104mol/L的百草枯連續(xù)進(jìn)行平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0％，加標(biāo)回收率在85.4％-109.2％之間。
　　 3. pH=7.3的Tris-HCL緩沖溶液中，百草枯在260nm處有紫外吸收峰，且百草枯對(duì)NR-ctDNA體系的紫外光譜和熒光光譜均能產(chǎn)生有規(guī)律的影響。
　　 4.從發(fā)

8、育4h開(kāi)始，百草枯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯的效應(yīng)，在顯微鏡下可以觀察到卵凝結(jié)、無(wú)心跳、無(wú)血液循環(huán)、心包水腫等異常表現(xiàn)，百草枯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育最重要的影響是72h孵化，其EC50-387.6mmol/L，而孵化后的各種畸形與陰性對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1.離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定植物中的百草枯方法簡(jiǎn)便，結(jié)果滿意，百草枯在自然環(huán)境中的代謝速度高于放置在冰箱中的代謝速度。
　　 2.化學(xué)發(fā)光法測(cè)定蔬