久效磷對(duì)斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定的胚胎毒性，能夠影響胚胎的發(fā)育。實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎能夠影響其生殖腺的發(fā)育，導(dǎo)致卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞形態(tài)和排列的異常。為進(jìn)一步探究久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，本文統(tǒng)計(jì)分析了久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活率、孵化率、心跳、畸形情況（心包囊腫和骨骼彎曲）、運(yùn)動(dòng)行為（自發(fā)運(yùn)動(dòng)）以及生長(zhǎng)水平（頭長(zhǎng)和體長(zhǎng)）的影響，首先從個(gè)體水平上探討了久效磷的胚胎毒性。多種基因參與調(diào)控了斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育，久效磷暴露斑馬魚(yú)導(dǎo)致的心包囊

2、腫、脊柱彎曲和性腺結(jié)構(gòu)異?？赡苁且?yàn)槠溆绊懥税l(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，而外源物質(zhì)能夠通過(guò)改變基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平來(lái)影響基因的表達(dá)。因此，本文進(jìn)一步研究了久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎對(duì)心臟發(fā)育基因(Tbx2)、肌肉發(fā)育基因(Mef2c)和性腺發(fā)育基因(Vasa) mRNA表達(dá)水平的影響，以及久效磷暴露斑馬魚(yú)對(duì)Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的影響，從分子水平探討了久效磷對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的潛在機(jī)制。本文研究結(jié)果表明:
　　(1)0.0004、

3、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至96hpf(hourpost fertilization)，對(duì)胚胎的存活率、死亡率、頭長(zhǎng)、體長(zhǎng)以及自發(fā)運(yùn)動(dòng)均無(wú)顯著影響。久效磷暴露顯著降低了36hpf斑馬魚(yú)胚胎的心跳，升高了96hpf仔魚(yú)心包囊腫和脊柱彎曲的百分比，說(shuō)明久效磷具有胚胎毒性，主要表現(xiàn)為致畸性，能夠影響斑馬魚(yú)心臟和骨骼的發(fā)育。
　　(2)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎

4、至96hpf,采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)48和60hpf心臟發(fā)育相關(guān)基因T盒子2(Tbx2)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(Mef2c)，以及48、60和96hpf性腺發(fā)育相關(guān)基因Vasa(DEAD-family protein ofATP-dependent RNA helicase) mRNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，久效磷暴露降低了48hpf胚胎Tbx2基因的表達(dá)水平，而對(duì)60hpf胚胎Tbx2基因表達(dá)水平無(wú)影響;

5、暴露升高了48hpf胚胎Mef2c基因的表達(dá)水平，但是，對(duì)60hpf胚胎Mef2c基因表達(dá)水平無(wú)影響，說(shuō)明久效磷可能是通過(guò)影響Tbx2和Mef2c基因在心臟發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)(48hpf內(nèi))的表達(dá)水平，進(jìn)而影響心臟的正常發(fā)育。另外，久效磷暴露對(duì)96hpf胚胎Vasa基因表達(dá)水平無(wú)影響，但降低了48和60hpf胚胎Vasa基因的表達(dá)水平，可能會(huì)對(duì)PGCs的遷移過(guò)程產(chǎn)生影響。
　　(3)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久

6、效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至96hpf，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序(BSP)方法檢測(cè)Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)48、60和96hpf DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Dnmt1)以及基化CpG連接蛋白2基因(Mecp2) mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明:久效磷暴露斑馬魚(yú)胚胎至48、60和96hpf，Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平均無(wú)顯著差異，說(shuō)明久效磷可能不是通過(guò)影響Vasa基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平來(lái)影響其基因表達(dá)的。

7、另外，久效磷暴露對(duì)Dnmt1基因的表達(dá)無(wú)影響，卻升高了Mecp2基因的表達(dá)水平，說(shuō)明組蛋白的去乙?；图谆赡苁蔷眯Я子绊慥asa基因表達(dá)的潛在機(jī)制。
　　綜上，本研究表明，久效磷具有胚胎毒性，在個(gè)體水平上，能夠影響心臟和骨骼的發(fā)育，導(dǎo)致心包囊腫和骨骼彎曲;在分子水平上，久效磷能夠通過(guò)影響心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2、肌肉發(fā)育基因Mef2c以及性腺發(fā)育相關(guān)基因Vasa的表達(dá)水平，進(jìn)而影響心臟和性腺發(fā)育;并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基