脊髓Toll樣受體4在大鼠脛骨癌痛中的作用及不同參數(shù)電針緩解癌痛效果觀察.pdf

1、癌痛是臨床上常見的慢性病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者的日常生活。骨癌痛則是最常見的癌痛之一，骨癌痛不僅發(fā)生于原發(fā)性骨癌，同樣也可發(fā)生于骨轉(zhuǎn)移的繼發(fā)性骨癌。約1/3的晚期癌癥病人都可能發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移也被認(rèn)為是癌癥引起疼痛最常見的原因。盡管世界衛(wèi)生組織(WHO)倡導(dǎo)的癌痛三級階梯療法（根據(jù)疼痛的程度不同給予非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥和/或阿片類藥物治療），在癌痛的治療中具有指導(dǎo)性意義并取得了一定成效，但由于各種藥物療法引起的免疫抑制、胃腸道反應(yīng)、耐受成

2、癮，以及因個體差異出現(xiàn)的部分患者的癌痛對這些療法不敏感等因素，以至仍有約50％癌痛患者得不到有效控制。因此，研究癌痛機理、尋求有效的控制癌痛的方法仍然是慢性痛研究領(lǐng)域的熱點之一。
　　癌痛時，最突出的現(xiàn)象是脊髓背角內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞大量增生與活化，膠質(zhì)細胞活化后分泌的一系列細胞因子和生長因子改變了神經(jīng)元周圍的神經(jīng)化學(xué)微環(huán)境，形成中樞敏化，加劇疼痛。有研究表明，抑制膠質(zhì)細胞的活化能夠起到鎮(zhèn)痛作用，說明膠質(zhì)細胞的活化在細胞水平參與了癌痛

3、的發(fā)生。然而，脊髓背角的膠質(zhì)細胞是如何活化的？是什么因素激活了這些膠質(zhì)細胞？是值得研究的問題。
　　Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR，因編碼基因與果蠅體內(nèi)的Toll基因相似而得名），是存在于單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞和中性粒細胞表面的一種膜受體。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的Toll樣受體2和4（TLR2、TLR4）表達于星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表面，能夠參與膠質(zhì)細胞的激活過程，引起炎性細胞因子釋放，介導(dǎo)疼痛的產(chǎn)生

4、。那么，TLR是否與癌痛時膠質(zhì)細胞的激活有關(guān)？TLR在癌痛發(fā)生發(fā)展過程起怎樣作用？抑制TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否緩解癌痛？等等問題，有待研究。
　　熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的內(nèi)源性配體信號。已知，HSP60能通過TLR4誘導(dǎo)天然免疫系統(tǒng)發(fā)生促炎癥反應(yīng)，也可以通過TLR的介導(dǎo)使NF-κB， P38 MAPK激活，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。有研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，HSP表達升高

5、，表明TLR信號通路傳導(dǎo)增強，暗示其促炎反應(yīng)加強。然而，在骨癌痛時，脊髓背角的HSP有何變化？它是否參與了TLR介導(dǎo)的膠質(zhì)細胞的活化？目前尚不明確。
　　祖國醫(yī)學(xué)向來重視對癌痛的認(rèn)識與調(diào)治。中醫(yī)認(rèn)為癌痛是由氣機失調(diào)，瘀血阻滯，痰凝積結(jié)，濕邪內(nèi)阻，毒火結(jié)聚，虛衰失調(diào)等引起經(jīng)絡(luò)不通所致。針刺則能夠通經(jīng)絡(luò)，調(diào)氣血。大量臨床實踐證實，針刺療法對急、慢性痛都有明顯的鎮(zhèn)痛作用。不少臨床研究報道表明，針刺療法能有效地緩解癌痛。不過目前已有報道的

6、實驗設(shè)計尚存不足，本實驗通過選取多個針刺穴位、不同電針參數(shù)，在癌痛的不同時程給予癌痛動物電針治療等，可以彌補以前的不足，有利于評價電針治療在癌痛中的作用。
　　根據(jù)上述分析和提出的疑問，本論文進行了下列研究:
　　參照實驗室前期工作，通過脛骨骨髓腔注入腫瘤細胞，建立了大鼠脛骨癌痛模型，檢測模型動物的體重、脛骨的大體形態(tài)和組織病理變化、后肢機械性痛覺超敏等指標(biāo)，對動物模型進行了綜合評估。運用RT-PCR、ELISA等分子生物學(xué)

7、技術(shù)，檢測癌痛大鼠模型脊髓背角TLR和HSP的表達變化;鞘內(nèi)（脊膜腔內(nèi)）給予Naloxone（納洛酮，阿片受體阻斷劑）和LPS-RS(TLR4外源性配體LPS的類似物)阻斷TLR4傳導(dǎo)通路，用von-Frey纖維毛測定Naloxone和LPS-RS對癌痛大鼠機械性痛覺超敏的影響;鞘內(nèi)給予Naloxone和LPS-RS后，取大鼠脊髓腰膨大部位，以RT-PCR檢測脊髓背角炎性細胞因子mRNA表達。以求從不同角度認(rèn)識脊髓背角TLR在癌痛中的作

8、用。
　　本研究還探討了不同電針參數(shù)對脛骨癌痛機械性痛覺超敏的影響:(1)單次電針對大鼠脛骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響;(2)累加電針對大鼠脛骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響。
　　實驗結(jié)果如下:
　　1.大鼠脛骨癌痛模型建立
　　實驗采用微量進樣器直接穿刺向Wistar大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種Walker256乳腺癌細胞，建立大鼠脛骨癌痛模型。Wistar大鼠被隨機分成四組:正常組（不做任何處理）、PBS組（脛骨內(nèi)注入

9、PBS）、熱滅活腫瘤細胞組（脛骨內(nèi)注入熱滅活的腫瘤細胞）、腫瘤細胞組（脛骨內(nèi)注射4×105 Walker256乳腺癌細胞）。
　　與正常組、PBS和熱滅活腫瘤細胞組大鼠相比，隨著腫瘤細胞生長，腫瘤組大鼠脛骨逐出現(xiàn)空洞，骨表面粗糙不平，骨質(zhì)明顯破壞; HE染色切片可見明顯的腫瘤生長、骨質(zhì)破壞以及新生骨形成。大鼠接種腫瘤細胞后，體重逐漸下降，接種側(cè)后肢逐漸產(chǎn)生機械性痛覺超敏，疼痛行為隨時間及骨破壞的加重而加重。這些實驗結(jié)果表明大鼠脛骨

10、癌痛模型建立成功。
　　2.TLR／HSP在大鼠脛骨癌痛中的作用
　　2.1大鼠脛骨癌痛時脊髓背角TLR4表達變化
　　用RT-PCR方法檢測了正常組、PBS組、熱滅活腫瘤細胞組、腫瘤細胞組（處理方法同前）各組大鼠脛骨癌痛時脊髓背角TLR2、3、4的表達變化。結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，腫瘤細胞組大鼠雙側(cè)脊髓背角TLR4mRNA在建模后第8天開始隨著腫瘤生長逐漸增高。接種腫瘤細胞后第16天，雙側(cè)脊髓背角TLR4 mRN

11、A顯著增高(p＜0.01)。PBS組、熱滅活腫瘤細胞組大鼠與正常組大鼠相比TLR4 mRNA的表達無顯著改變。
　　2.2大鼠脛骨癌痛時脊髓背角HSP的表達變化
　　用ELISA方法檢測了正常組、PBS組、腫瘤細胞組大鼠脛骨癌痛時脊髓背角HSP60、70的變化。結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，大鼠脛骨接種腫瘤細胞后第8天，雙側(cè)脊髓背角的HSP60的表達開始增高，16天顯著增高。PBS組與正常組大鼠相比無顯著改變。
　　2.

12、3 Naloxone抑制TLR4信號通路后，對大鼠脛骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響
　　Naloxone能與TLR4結(jié)合而抑制TLR信號通路的傳導(dǎo)。本實驗對脛骨內(nèi)注入Walker256乳腺癌細胞的大鼠，或不作任何處理，或鞘內(nèi)（脊膜腔內(nèi)）注入Naloxone(60μg/20μl)或生理鹽水，分別形成單純模型組、Naloxone組、生理鹽水組，鞘內(nèi)注射于建模后第8、12、16天實施，注射后45、90、135、180min時，測定大鼠后肢

13、機械性痛覺超敏變化。結(jié)果顯示，在癌痛第8天、12天時給予鞘內(nèi)注射Naloxone阻斷TLR4信號通路能明顯緩解脛骨癌痛時的機械性痛覺超敏(p＜0.05);癌痛16天時Naloxone組與生理鹽水組的機械性痛閾未見明顯差異。提示通過Naloxone抑制TLR信號通路能在癌痛前期緩解機械性痛覺超敏。
　　2.4 LPS-RS競爭結(jié)合TLR4后對大鼠脛骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響
　　由于作為TLR4外源性配體類似物的LPS-RS

14、，能與TLR4結(jié)合后能競爭性抑制TLR4與其它配體的結(jié)合，阻斷其信號傳導(dǎo)，因此，本文設(shè)計了LPS-RS用藥后，驗證TLR4作用的實驗。本實驗對脛骨內(nèi)注入Walker256乳腺癌細胞的動物，或不作任何處理，或鞘內(nèi)（脊膜腔內(nèi)）注入LPS-RS(20μg/20μl)或生理鹽水，分別形成單純模型組、LPS-RS組、生理鹽水組，鞘內(nèi)注射于建模后第8、12、16天實施，注射后45、90、135、180min時測定大鼠后肢機械性痛覺超敏。結(jié)果顯示，在

15、癌痛第8天、12天時給予鞘內(nèi)注射LPS-RS能明顯緩解脛骨癌痛時的機械性痛覺超敏;癌痛16天時LPS-RS組與生理鹽水組的機械性痛閾未見明顯差異。說明LPS-RS能在癌痛前期緩解機械性痛覺超敏。
　　2.5 Naloxone阻斷TLR4信號通路對大鼠脊髓背角炎性細胞因子表達的影響
　　本實驗室以往工作顯示，癌痛時大鼠脊髓背角炎性細胞因子表達增高。那么，若抑制TLR4信號通路，是否能夠降低炎性細胞因子的表達？本實驗按2.3中所

16、述方法將大鼠分為單純模型組、Naloxone組、生理鹽水組，于建模后第8、12天分別給予鞘內(nèi)注射Naloxone或生理鹽水，90min后處死動物，取脊髓背角，用RT-PCR法檢測了脊髓背角炎性細胞因子白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達變化。結(jié)果顯示，與模型組相比，第12天時，Naloxone顯著降低了脊髓背角IL-1β、TNF-α mRNA表達，而生理鹽水對炎性細胞因子mRNA表達無明顯作用。
　　小

17、結(jié):本實驗觀測到癌痛大鼠雙側(cè)脊髓背角TLR4表達增多，HSP60含量提高;通過Naloxone或LPS-RS抑制TLR4信號傳導(dǎo)通路，可緩解癌痛時大鼠機械性痛覺超敏，降低脊髓炎性因子mRNA表達，提示阻斷TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可抑制膠質(zhì)細胞的激活，也就是說，脊髓膠質(zhì)細胞的激活可能是通過TLR4信號傳導(dǎo)通路而完成。而HSP60在TLR4信號傳導(dǎo)路中所起的作用還需要進一步的研究。
　　3.電針對癌痛的作用
　　3.1單次電針對大鼠脛

18、骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響
　　實驗采用配伍選穴，對大鼠對側(cè)“足三里/昆侖”和“足三里/環(huán)跳”作電針刺激觀察。于建模后第6日（癌痛早期））和第16日（癌痛晚期）通過韓氏電針治療儀給予“連續(xù)波”(頻率15Hz)刺激，強度2-5mA(以出現(xiàn)后肢肌肉輕微抖動，而動物不嘶叫為宜)，電針治療時間為30分鐘。測定電針后15、30、45、60、120min時大鼠后肢機械性痛覺超敏。結(jié)果顯示，在癌痛的早期或晚期給予單次電針治療，電針組與模型組大

19、鼠機械性痛覺超敏均無顯著性差異，說明單次電針不能效緩解脛骨癌痛時的機械性痛覺超敏。
　　3.2多次電針對大鼠脛骨癌痛時機械性痛覺超敏的影響
　　同樣采用配伍取穴，實驗分別對大鼠對側(cè)“足三里/環(huán)跳”穴于建模后第6-16天內(nèi)用韓氏電針治療儀給予“連續(xù)波”(頻率15HZ)或疏密波(2/100HZ)刺激，強度同上(2-5mA)，電針治療時間為30分鐘。隨后測定大鼠后肢機械性痛覺超敏的變化。結(jié)果顯示，癌痛時給予多次電針治療后，電針組與

20、模型組的機械性痛覺超敏均無顯著性差異，說明累加電針同樣不能有效緩解脛骨癌痛時的機械性痛覺超敏。
　　小結(jié):通過不同穴位配伍、不同頻率、不同時間點的電針治療，發(fā)現(xiàn)電針對于脛骨癌痛引起的機械性痛覺超敏沒有明顯的緩解作用，提示電針鎮(zhèn)痛具有局限性。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明:
　　1.大鼠脛骨骨髓腔接種腫瘤細胞后表現(xiàn)出骨質(zhì)破壞、機械性痛覺超敏，說明骨癌痛模型建立成功。
　　2.大鼠脛骨癌痛時，雙側(cè)脊髓背角TLR4 m

21、RNA表達升高，HSP60含量增加，提示癌痛時TLR4信號傳導(dǎo)通路被激活，HSP60可能參與其中。
　　3.Naloxone和LPS-RS抑制TLR4信號通路后能在早期緩解癌痛時大鼠機械性痛覺超敏，其可能機制是抑制了TLR-膠質(zhì)細胞-炎性細胞因子通路。
　　4.不同穴位配伍、不同頻率、不同強度的電針治療均對大鼠機械性痛覺超敏無明顯緩解作用，說明了電針鎮(zhèn)痛在癌痛的治療中有一定的局限性。但不能由此否認(rèn)電針針刺對提高藥物鎮(zhèn)痛效果等