DEN誘發(fā)大鼠肝癌形成過程中差異表達(dá)蛋白質(zhì)組分析及AKR1B10的研究.pdf

1、本研究用二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌形成，以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)染色陽(yáng)性的肝細(xì)胞增生灶(γ-GT陽(yáng)性灶)為標(biāo)志獲取肝癌前病變的組織標(biāo)本，再用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)大鼠肝癌組織、肝癌前病變組織和正常肝組織的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，篩選出一批差異表達(dá)蛋白。隨后，本研究對(duì)部分篩選出來的差異表達(dá)蛋白質(zhì)如醛糖還原酶1B10(AKR1B10)、波形蛋白(VIMENTIN)進(jìn)行表達(dá)水平改變的驗(yàn)證，再應(yīng)用RNA干擾(RNA)技術(shù)對(duì)AK

2、R1B10進(jìn)行腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能分析和機(jī)制探討，以及應(yīng)用組織芯片和免疫組化技術(shù)觀察和分析AKR1B10在較大樣本量的人肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。研究結(jié)果表明，AKR1B10在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖和凋亡能力，它在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌組織的分化程度相關(guān)，在血清甲胎蛋白(α-fetal protein，AFP)陰性患者的肝癌組織中高表達(dá)。這些結(jié)果提示AKR1B10對(duì)預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生和預(yù)后可能有

3、一定的價(jià)值，是一種具有潛在應(yīng)用前景的肝癌早期診斷的分子標(biāo)志物。本研究分為四個(gè)部分： 第一部分，DEN誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生過程中差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。建立DEN誘發(fā)大鼠肝癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑧?yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展不同階段的肝組織中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，從中篩選出在肝癌發(fā)生過程中起重要作用的候選蛋白。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組共有9只動(dòng)物發(fā)生肝癌，肝癌發(fā)生的最早時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第21周；對(duì)照組無1例發(fā)生肝癌。γ-GT組織化學(xué)染色顯示隨著DEN

4、誘癌時(shí)間延長(zhǎng)，γ-GT陽(yáng)性灶數(shù)量增多、面積增大，癌前組織中γ-GT陽(yáng)性灶總面積與肝組織切片面積比達(dá)29％～43％；肝癌組織γ-GT染色全為陽(yáng)性；正常肝組織內(nèi)無γ-GT陽(yáng)性灶。應(yīng)用2-DE技術(shù)篩選出組間表達(dá)水平差異≥2倍或特異存在的蛋白點(diǎn)127個(gè)，質(zhì)譜鑒定出AKR1B10、VIMENTIN和粘連蛋白受體1(laminin receptor1，LAMR1)等82種蛋白質(zhì)，其中肝癌組織與正常組織相比有75個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，肝癌組織與癌前組織相

5、比有39個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，癌前組織與正常組織相比有14個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在以上三種比較中同時(shí)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)有5個(gè)。生物信息學(xué)分析顯示，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體；發(fā)揮酶的活性作用、氧化還原和結(jié)合等功能；參與的主要生物學(xué)過程為代謝、運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移、生物合成和氧化應(yīng)激等。應(yīng)用IntACT數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)現(xiàn)4型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)共同節(jié)點(diǎn)。 第二部分，差異表達(dá)蛋白AKR1

6、B10和VIMENITN在大鼠和人肝癌組織中的表達(dá)驗(yàn)證。研究方法主要為應(yīng)用Western blot和RT-PCR方法分別檢測(cè)AKR1B10和VIMENTIN在大鼠和人肝癌組織中的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的表達(dá)情況，以及應(yīng)用免疫組化染色觀察AKR1B10在肝細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示：①AKR1B10蛋白定位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，其蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中依次上調(diào)；AKR1B10蛋白表達(dá)水平在人正常肝、癌旁

7、肝及肝癌組織中也依次上調(diào)。②VIMENTIN蛋白在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中表達(dá)依次明顯上調(diào)；VIMENTINmRNA在大鼠肝癌組織中明顯升高，在肝癌前病變組織中輕度升高但與正常肝組織間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VIMENTIN蛋白在人正常肝、癌旁肝及肝癌組織中的表達(dá)依次上調(diào)。結(jié)果顯示的AKR1B10和VIMENTIN的表達(dá)變化趨勢(shì)與2-DE結(jié)果基本一致，提示本研究采用的2-DE和MALDI-TOF-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)具有相

8、當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和可靠性。在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上，AKR1B10和VIMENTIN不僅在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中表達(dá)依次上調(diào)，并且在人正常肝、肝癌旁組織、肝癌組織中的表達(dá)水平也顯著依次升高，提示這兩個(gè)蛋白可能參與人類肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。 第三部分，AKR1B10在肝癌發(fā)生過程中作用及機(jī)制的初步探討。應(yīng)用RNAi技術(shù)和腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能鑒定方法，觀察AKR1B10表達(dá)被抑制后對(duì)人肝癌細(xì)胞系MHCC97H相關(guān)功能的影響，并

9、探討其機(jī)制。應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測(cè)AKP1B10 mRNA和蛋白在肝癌細(xì)胞系MHCC97L、MHCC97H、SMMC-7721和BEL-7402及正常肝細(xì)胞系Changliver中的表達(dá)以篩選AKR1B10表達(dá)量最高的細(xì)胞系，然后采用RNAi技術(shù)，將化學(xué)合成的兩對(duì)針對(duì)AKR1B10的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞MHCC97H細(xì)胞，再通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(

10、real-time PCR)、細(xì)胞免疫熒光、Western blot及AKR1B10酶活性檢測(cè)，篩選干擾效果最明顯的一對(duì)siRNA作RNAi組，另設(shè)置陰性對(duì)照組(Mock，轉(zhuǎn)染無效用的dsRNA)和空白對(duì)照組(Con，不作任何轉(zhuǎn)染)，最后觀察AKR1B10表達(dá)下調(diào)后對(duì)MHCC97H細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附、運(yùn)動(dòng)等腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能的影響，并用Real-time PCR檢測(cè)干擾AKR1B10表達(dá)后c-myc等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示

11、，AKR1B10在所檢測(cè)的四種肝癌細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)，以在MHCC97H細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)；在正常肝細(xì)胞Changliver中無表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AKR1B10-siRNA48h和72h后，MHCC97H細(xì)胞中的AKR1B10mRNA和蛋白表達(dá)受到較為明顯的抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AKR1B10表達(dá)被干擾后MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，抑制率在24h、48h、72h和96h分別為6.5％、18.0％、26.6％和22.7％。流式細(xì)

12、胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示RNAi組的凋亡細(xì)胞比例顯著高于與陰性和空白對(duì)照組，三組分別為37.30％、5.18％和5.57％(p＜0.05)。粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RNAi組在30min、50min和70min時(shí)的粘附細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照組和空白組均無明顯差異。體外運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RNAi組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中MHCC97H細(xì)胞穿過微孔濾膜到達(dá)下室面的細(xì)胞數(shù)分別為21±4、20±3和18±2個(gè)，三組間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Real-time PCR檢

13、測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾AKR1B10表達(dá)后，RNAi組中癌基因c-myc、c-fos、N-ras和增殖相關(guān)基因ki-67表達(dá)下降，促凋亡基因casps-3和bax表達(dá)上調(diào)。 第四部分。AKR1B10在較大樣本人肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義的研究本部分利用組織芯片和免疫組化技術(shù)檢測(cè)AKR1B10蛋白在65例人肝癌及其相應(yīng)癌旁組織、14例正常人肝組織中的表達(dá)情況，分析肝癌組織中AKR1B10蛋白表達(dá)與患者的臨床病理特征的關(guān)系，評(píng)估AKR1B10作

14、為新的肝癌早期診斷分子標(biāo)志物的可能性。結(jié)果顯示AKR1B10蛋白在人正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌組織中的表達(dá)率和表達(dá)量均依次升高，并且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.05)。AKR1B10在肝癌組織的表達(dá)水平與該組織的Edmondson病理分級(jí)相關(guān)，即其表達(dá)量在分化程度為I～I(xiàn)I級(jí)的肝癌組織中顯著高于III～I(xiàn)V級(jí)(p<0.05)。65例肝癌組織中AKR1B10陽(yáng)性表達(dá)率為76.92％，明顯高于本組患者術(shù)前血清AFP陽(yáng)性率(55.38％，

15、p<0.05)。在28例術(shù)前血清AFP陰性的肝癌組織中，21例(75.0％)顯示為AKR1B10表達(dá)陽(yáng)性?？ǚ綑z驗(yàn)顯示AKR1B10在肝癌患者組織中的表達(dá)與術(shù)前血清AFP無相關(guān)性(p>0.05)。 研究表明：⑴應(yīng)用γ-GT組織化學(xué)染色和HE染色相結(jié)合的辦法有助于識(shí)別和準(zhǔn)確獲取大鼠肝癌前病變組織用于比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)觀察肝癌形成過程中差異表達(dá)蛋白。⑵本研究通過2-DE和質(zhì)譜技術(shù)篩查出的一系列與肝癌相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)