AKR1B10蛋白對αβ—不飽和羰基的解毒作用.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文AKR1B10蛋白對αβ—不飽和羰基的解毒作用姓名：鐘琳琳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：方秀斌20090401二醛有致病性，特別是在潰瘍性結(jié)腸炎中與腫瘤損傷相關(guān)。另外，消耗酒精引起乙醛的局部積累，被認(rèn)為是結(jié)腸癌和胃癌的局部致癌因子。但是，宿主對這些飲食中和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的毒素的防御機(jī)制還不十分清楚。本研究的意義在于，從分子生物學(xué)角度，闡述AKRlBIO參與機(jī)體對外源性和內(nèi)源性羰基侵害的保護(hù)機(jī)

2、制，希望為進(jìn)一步闡明腫瘤發(fā)生的機(jī)理和尋找防治腫瘤的新藥物提供理論依據(jù)。方法第一部分：基因重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白／醛酮還原酶1BIO(EGFP—C3／AKRlBl0)質(zhì)粒的構(gòu)建，AKRlBl0蛋白的純化及制備AKRlBl0抗體為了監(jiān)測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，采用DNA重組技術(shù)，將人全長AKRlBl0插入到EGFPC3載體中，經(jīng)酶切等方法鑒定目的基因連接成功。使用pQE原核蛋白表達(dá)體系純化AKRlBl0和AKRlBl蛋白，得到高純度的AKRlBl0

3、蛋白用于酶動力學(xué)檢測，AKRIBl作為對照。使用SulfoLinkImmobilizationKit制備高特異性的AKRlBl0抗體。第二部分：AKRlBl0蛋白酶動力學(xué)檢測在高濃度底物的動力學(xué)分析中，使用分光光度計檢測340納米處吸光度的降低反映酶的活性，減少的NADPH可以用氧化的NADPH／min／mgprotein表示。在生理狀態(tài)下，人類暴露于羰基的濃度較低，為了了解AKRlBl0在生理狀態(tài)下的解毒功能，我們使用高壓液相儀(HP

4、LC)來監(jiān)測低濃度羰基及其耦合物時酶催化能力，并用質(zhì)譜儀證實酶還原產(chǎn)物。第三部分：AKRlBl0蛋白對293T細(xì)胞的保護(hù)作用用熒光顯微鏡觀察293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFPC3／AKRlBl0和EGFPC3的轉(zhuǎn)染效率。由Westernblot檢測EGFPC3／AKRlBl0的蛋白表達(dá)。用甘油醛作為底物，觀察細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)的EGFPC3／AKRlBl0蛋白是否具有功能。采用MTT比色法檢測不同濃度HNE對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。HPLC觀察HNE