重組腺病毒AdCTLA4-FasL聯(lián)合供者骨髓細胞輸注方案誘導異基因混合嵌合耐受的實驗研究.pdf

1、[目的]異基因混合嵌合體能誘導受者對供者移植器官特異耐受，從而能夠避免器官移植后長期運用免疫抑制藥物。但是，迄今為止還沒有一種安全高效的異基因混合嵌合體誘導方案可供臨床運用。在不對受體清髓處理的情況下，本研究探討運用重組腺病毒AdCTLA4-FasL聯(lián)合供者骨髓移植方案能否誘導混合嵌合體和同種皮膚移植耐受，同時探討免疫抑制藥物對該方案誘導的混合嵌合耐受的影響。 [方法]1.運用Adeasy系統(tǒng)重組腺病毒AdCTLA4-FasL，

2、酶切、PCR、WesternBlot鑒定。2.將BALB/c(H-2d)小鼠皮膚移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同時經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細胞和腺病毒AdCTLA4-FasL；運用ELISA檢測CTLA4-FasL融合蛋白在血漿中的表達，組織學分析了解該融合蛋白的肝細胞毒性，F(xiàn)ITC標記的抗H-2d單抗對受體小鼠外周血白細胞標記后進行流式細胞儀分析檢測異基因嵌合水平，觀察皮膚移植物存活情況，運用有限稀釋混合淋巴細胞

3、培養(yǎng)方法估計輔助性T淋巴細胞前體(HTLp)和細胞毒T淋巴細胞前體(CTLp)的頻數(shù)。3.將BALB/c(H-2d)小鼠皮膚移植于C57BL/6(H-2b，B6)小鼠，同時經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細胞和腺病毒AdCTLA4-FasL，術(shù)后4周每天注射環(huán)孢素A(CsA)或霉酚酸酯(MMF)；然后觀察移植皮膚存活情況，通過流式細胞儀測定受體外周血Vβ11+的T細胞的水平和供體來源細胞的嵌合水平，通過單向混合淋巴細胞反應了解對供體抗原

4、的耐受狀態(tài)。 [結(jié)果]1.重組腺病毒AdCTLA4-FasL的DNA通過PacI酶切證實為同源重組后的腺病毒，用特異引物經(jīng)PCR證實含有外源基因CTLA4-FasL，WesternBolt表明細胞感染重組腺病毒AdCTLA4-FasL后能表達分泌性的融合蛋白CTLA4-FasL。2.腺病毒AdCTLA4-FasL能夠在小鼠體內(nèi)表達CTLA4-FasL融合蛋白，持續(xù)約56天左右，且無明顯肝細胞毒性。該聯(lián)合方案誘導了持久(140d時

5、供體細胞＞20％)宏嵌合體(macrochimerism)；同時這種嵌合體促進了穩(wěn)定的供體特異性耐受，BALB/c小鼠的皮膚移植物在B6受體小鼠中長期存活[themeansurvivaltime(MST)＞200d]，而來源于C3H小鼠的第三者皮膚移植物被該嵌合體小鼠正常排斥。該聯(lián)合方案處理的B6小鼠在接受皮膚移植14天后，輔助性T淋巴細胞前體(HTLp)和細胞毒T淋巴細胞前體(CTLp)的頻數(shù)降低到很低的水平，表明AdCTLA4-Fa

6、sL能夠迅速促進全面的外周耐受，從而有利于供體骨髓細胞植入。接受皮膚移植140天后，供體皮膚僅在形成長期嵌合體的受體小鼠中繼續(xù)存活，這些小鼠體內(nèi)供體特異性的HTLp和CTLp的頻數(shù)減少，提示長期的皮膚移植物耐受與穩(wěn)定的混合嵌合體有關，中樞性T細胞刪除可能是耐受維持的主要機制。3.聯(lián)合方案處理后短期加用免疫抑制藥物均促進早期供體骨髓細胞植入；但單用CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠在皮膚移植后140d時混合嵌合降低到很低水平；單用CsA

7、或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠中供體皮膚平均生存時間顯著低于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠(p＜0.05)；皮膚移植后21d時CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠Vβ11+的T細胞水平顯著高于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠(p＜0.05)；皮膚移植后150d時CsA或CsA與MMF聯(lián)用的受體小鼠脾細胞未顯示對同種抗原特異性耐受。 [結(jié)論]1.成功制備具有完整功能和感染能力的重組腺病毒AdCTLA4-FasL。2.Ad