Parkin與OGCP相互作用研究及OGCP基因的突變檢測.pdf

1、第一部分Parkin與OGCP相互作用研究 ParkSn基因是帕金森病的致病基因之一，Parkin蛋白作為泛素-蛋白酶體通路(UPP)的一種E3酶，介導(dǎo)了多種底物蛋白的泛素化過程，后者與帕金森病的發(fā)病機制有著密切的聯(lián)系。α-酮戊二酸載體蛋白(OGCP)位于線粒體上。在本課題中，我們對Parkin與OGCP之間的相互作用進行研究。 應(yīng)用PCR技術(shù)從人胎腦cDNA文庫擴增全長的Parkin和OGCP基因的CDS，亞克隆至pC

2、MV-Tag4和pcDNA3.l-myc-his(一)B表達載體，構(gòu)建Parkin和OGCP的真核表達載體pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP，經(jīng)測序證實了載體構(gòu)建正確。將pCMV-Parkin和pcDNh3.1-myc-OGCP轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，用免疫印跡、免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP能正確地表達出Parkin-Flag融合蛋白(54

3、KD)和OGCP-myc融合蛋白(38KD)；Parkin-Flag融合蛋白分布在胞漿和胞核中，而OGCP-myc融合蛋白分布在胞漿中，定位在線粒體上；Flag和myc與Parkin和OGCP的融合并沒有改變Parkin和OGCP的亞細胞定位。此外，還成功地建立了OGCP-myc穩(wěn)定表達的HEK293細胞。 應(yīng)用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡共定位技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)DCMv-Parkin和pcDNA3.1myc-OGCP的HEK293

4、細胞中，Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在共定位；免疫共沉淀試驗證實了Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在相互作用。表明Parkin和OGCP是一對相互作用蛋白。 體外泛素化實驗發(fā)現(xiàn)Parkin-Flag融合蛋白在E1酶、UbcH7和泛素存在的條件下，能介導(dǎo)OGCP-myc融合蛋白泛素化；體內(nèi)泛素化實驗也證明Parkin-Flag融合蛋白能介導(dǎo)OGCP-myc融合蛋白泛素化。表明

5、OGCP是Parkin的底物蛋白，Parkin介導(dǎo)了OGCP的泛素化。 用特異的蛋白酶體抑制劑和蛋白酶抑制劑對OGCP-myc／HEK293細胞進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑能減緩OGCP-myc融合蛋白的代謝和更新，提示蛋白酶體途徑和溶酶體途徑都參與了OGCP代謝。通過同位素<'35>S標記的脈沖追蹤實驗，發(fā)現(xiàn)OGCP-myc融合蛋白的代謝半衰期大約為8-10小時，Parkin-Flag融合蛋白能促進OGCP-myc融合蛋白的代謝和