GSTs和ITPA基因型和表型與IBD患者服用AZA發(fā)生不良反應(yīng)的相關(guān)性研究.pdf

1、硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)作為免疫抑制劑，在臨床上用于治療炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)。
　　 AZA為前體藥，本身無細(xì)胞毒性及免疫抑制作用，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)代謝為無治療活性的6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)，后者進(jìn)一步代謝后生成6-TGNs從而發(fā)揮藥效。中間產(chǎn)物

2、6-巰基單磷酸肌苷(6-thioinosine monophosphate，6-Thio-IMP)容易轉(zhuǎn)化成6-巰基三磷酸肌苷(6-thioinosine triphosphate，6-Thio-ITP)6-TITP。三磷酸肌苷焦磷酸酶(Inosine triphosphate pyrophosphohydrolase，ITPA)能將6-TITP催化再重新生成6-TIMP，保證活性代謝途徑繼續(xù)進(jìn)行。6-MP可由硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thio

3、purine S-methyhransferase，TPMT)，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)代謝生成無活性代謝產(chǎn)物。
　　 AZA治療中大約有15％-38％的患者發(fā)生不良反應(yīng)，目前有研究認(rèn)為TPMT基因型突變導(dǎo)致的活性降低可預(yù)測AZA不良反應(yīng)的發(fā)生情況。然而TPMT的基因突變頻率在中國人群中很低，因此不足以解釋中國人群中AZA代謝巨大的個體差異。
　　 AZA首先在GSTs催化下結(jié)合谷胱甘肽(g

4、lutathione，GSH)生成6-MP開始活性代謝途徑，所以GSTs為AZA體內(nèi)代謝的首個酶，具有非常重要的作用。大量研究顯示GSTs的突變率較高，且GSTs基因突變引起的酶活性的改變可能與AZA代謝的個體差異相關(guān)。如有研究發(fā)現(xiàn)攜帶缺失突變GSTM1的意大利青年IBD患者用AZA治療后出現(xiàn)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)低于野生型患者。另有研究指出，GSTP1基因突變與中國漢族健康人群中的活性的變化有相關(guān)性。然而，這種相關(guān)性是否同樣在IBD患者中存在

5、，個體酶活性的差異對AZA代謝導(dǎo)致的不良反應(yīng)的個體差異的影響尚未有報(bào)道。
　　 ITPA可減少6-TITP在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，從而減少毒副反應(yīng)。對體外樣本基因型與表型相關(guān)性的分析顯示，ITPA 94C＞A雜合子活性降低至野生型的25％～30％，突變純合子導(dǎo)致活性缺失或極低。IVS2+21A＞C等位基因突變純合子活性降低至野生型的60％。目前，對ITPA基因多態(tài)性引起AZA治療中不良反應(yīng)的研究較多，但結(jié)論仍存在爭議。因此，有必要研究在

6、中國IBD患者中ITPA基因型和活性對AZA導(dǎo)致的不良反應(yīng)的影響作用。
　　 綜上所述，GSTs和ITPA在AZA的代謝過程中起重要作用，其基因多態(tài)性和活性差異可能與AZA不良反應(yīng)的個體差異有關(guān)。
　　 因此，本研究擬以中國漢族IBD患者作為研究對象，以探討GSTs和ITPA基因多態(tài)性和表型對AZA治療過程中發(fā)生不良反應(yīng)的影響，為臨床更安全有效的使用AZA提供理論依據(jù)。
　　 第一部分、GSTs活性和基因型檢測。

7、
　　 目的：研究112名中國漢族IBD患者中GSTs基因多態(tài)性分布及紅細(xì)胞內(nèi)GSTs活性分布，考察與中國漢族健康人群間的差異。明確中國漢族IBD患者GSTs基因型和活性間的關(guān)系。
　　 方法：采用多重PCR和PCR-RFLP的方法檢測GSTs四個亞型突變位點(diǎn)GSTM1、GSTT1、GSTP1以及GSTA1在中國漢族IBD患者中的分布情況。采用紫外分光光度法檢測紅細(xì)胞內(nèi)GSTs的活性。
　　 結(jié)果：本部分研究中1

8、12例中國漢族IBD患者GSTM1、GSTT1、GSTP1以及GSTA1的突變頻率分別為52.7％、50.9％、34.8％和20.5％。紅細(xì)胞內(nèi)GSTs活性經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后呈正偏態(tài)分布，在患者中的GSTs突變頻率和活性分布均與健康漢人中的結(jié)果相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.025)。其中GSTP1-105Val突變型紅細(xì)胞內(nèi)GST活性平均值較野生型活性平均值高(P=0.025)。GSTP1基因型突變對紅細(xì)胞內(nèi)GSTs活性有明顯影響。而GST

9、M1、GSTT1和GSTA1基因型突變對活性的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：本研究中IBD患者的GSTs基因型頻率分布和活性與健康漢族人群中的分布無明顯差異。GSTP1基因型突變對紅細(xì)胞內(nèi)GSTs活性的有明顯影響，這與在中國漢族健康人群中GSTP1基因型與活性的關(guān)系一致。
　　 第二部分、ITPA活性和基因型檢測。
　　 目的：建立HPLC方法檢測紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性，并進(jìn)行驗(yàn)證。研究83名中國漢族IBD患者中

10、ITPA基因多態(tài)性分布及紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性分布，明確ITPA基因型和活性間的關(guān)系。
　　 方法：用PCR-RFLP的方法檢測ITPA兩個突變位點(diǎn)ITPA 94C＞A和IVS2+21A＞C在中國漢族IBD患者中的分布情況。建立檢測紅細(xì)胞內(nèi)ITPA的活性的HPLC方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立了紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性的HPLC檢測方法，方法學(xué)驗(yàn)證均符合生物樣本檢測的要求。
　　 2.本部分研究中83例患

11、者紅細(xì)胞ITPA活性為雙峰分布，活性平均值為231.4±93.3 U。性別間紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.本部分研究中ITPA 94C＞A突變雜合子發(fā)生頻率為36.1％，此位點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)突變純合子。未發(fā)現(xiàn)ITPA IVS2 21A＞C位點(diǎn)的突變個體。其中ITPA 94C＞A野生型患者紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性平均值高于突變雜合子活性(P=0.001)。ITPA94C＞A基因型突變對紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義。
　　 結(jié)論：本部分建立并確證的HPLC方法可滿足人紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性研究的要求。本研究中IBD患者的ITPA活性分布符合已報(bào)道的活性分布特征，ITPA94 C＞A基因型突變頻率體現(xiàn)中國人高突變的基因型分布特征。ITPA 94C＞A基因型突變對紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性有明顯影響。
　　 第三部分、GSTs和ITPA基因型和表型與IBD患者服用AZA發(fā)生不良反應(yīng)的相關(guān)性研究。
　　 目的：研究GSTs和ITPA

13、基因型和活性對AZA治療IBD患者中發(fā)生不良反應(yīng)的影響，為降低毒副反應(yīng)，制定合理的AZA治療方案提供理論指導(dǎo)。
　　 方法：本部分研究在第1部分，第2部分研究的基礎(chǔ)上，分析IBD患者GSTs和ITPA基因型和活性與使用AZA治療后發(fā)生不良反應(yīng)的相關(guān)性。采用單因素卡方分析基因型對骨髓抑制，胃腸道不適，感冒樣癥狀的影響。采用單因素T-檢驗(yàn)和非參檢驗(yàn)考察酶活性與三組不良反應(yīng)組之間的關(guān)系。最后通過多因素Logistics回歸分析以確定影

14、響最大的因素。
　　 結(jié)果：
　　 1.單因素分析結(jié)果：骨髓抑制組GSTM1野生型頻率顯著高于無不良反應(yīng)組，骨髓抑制組患者攜帶GSTP1野生型的機(jī)率高于無不良反應(yīng)組(P＜0.05)，骨髓抑制組的GSTs活性高于無不良反應(yīng)組(P＜0.05)；感冒樣癥狀組GSTM1野生型頻率顯著高于無不良反應(yīng)組(P＜0.05)。而ITPA基因型和活性與各個不良反應(yīng)組之間無顯著性相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 2.多因素回歸分析表明：

15、其中GSTPI(I/V)突變型組與GSTP1(I/I)野生型組比較風(fēng)險(xiǎn)較低，是患者的保護(hù)因素(P＜0.05，OR 0.125，95％CI 0.022-0.709)。紅細(xì)胞內(nèi)GSTs活性高的患者發(fā)生骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)是活性低的患者的11.680倍(P＜0.05，OR 11.680，95％CI 1.665-81.925)。GSTs基因型、活性以及參與的各相關(guān)因素與感冒樣癥狀組和胃腸道不適組之間均無顯著性統(tǒng)計(jì)意義(P＞0.05)。
　　

16、結(jié)論：在使用AZA治療的中國漢族IBD患者中，攜帶GSTP1野生基因型和GST酶活性高的患者有較大發(fā)生骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)。提示對于攜帶GSTP1野生型，GSTs活性高的患者可考慮使用6-MP代替AZA治療。
　　 論文總結(jié)：本研究首次在中國漢族IBD患者中進(jìn)行GSTs和ITPA基因多態(tài)性和活性研究，發(fā)現(xiàn)中國漢族人與中國漢族IBD患者的GSTs基因型分布頻率和活性分布相近，患者中ITPA基因型與已報(bào)道的其他亞洲人種相近，而和高加索人的

17、突變頻率相比均有較大種族差異；利用本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法，對IBD患者紅細(xì)胞內(nèi)ITPA活性進(jìn)行檢測，揭示了IBD患者ITPA活性分布與其他以報(bào)道的相似，但均值偏高。在回顧性分析發(fā)生不良反應(yīng)的影響因素中，首先單因素分析GSTs和ITPA的基因多態(tài)性和活性與AZA治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生的影響作用，發(fā)現(xiàn)GSTM1基因突變與骨髓抑制和流感樣癥狀有關(guān)，GSTP1基因突變與骨髓抑制發(fā)生有關(guān)。GSTs活性與骨髓抑發(fā)生有關(guān)。而ITPA基因型和活性的作

18、用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多因素Logistics分析研究GSTs基因型，活性以及臨床特征對AZA不良反應(yīng)的影響。發(fā)現(xiàn)在使用AZA治療中患者攜帶GSTP1突變基因型是保護(hù)因素，較GSTP1野生型發(fā)生骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)低，攜帶GSTP1野生型所發(fā)生不良反應(yīng)的患者占全部骨髓抑制患者的91％，而GST酶活性高患者發(fā)生骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)是低酶活性的患者的11.68倍。因此，對于攜帶GSTP1野生型，GSTs活性高的患者可考慮使用6-MP代替AZA治療。沒有足