P-gp介導(dǎo)的阿米替林與去甲替林中樞相互作用的體外與體內(nèi)研究.pdf

1、目的:
　　 考察地塞米松與維拉帕米對P-糖蛋白(P-gp)功能及表達(dá)影響的時(shí)效與量效關(guān)系及其對阿米替林與去甲替林外排速率及中樞分布的影響;評估P-gp介導(dǎo)的體外相互作用與腦內(nèi)相互作用的相關(guān)性，探討利用P-gp介導(dǎo)的相互作用促進(jìn)藥物療效與減少不良反應(yīng)的可行性。
　　 方法:
　　 1.采用Halo C18(2.1 mm×100 mm，2.7μm)色譜柱，純凈水-乙腈（v/v，60∶40）為流動相，采用Waters

2、 Micromass Quattro PremierXE二極質(zhì)譜儀為檢測器，建立UPLC-MS/MS同時(shí)測定阿米替林與去甲替林含量的方法。
　　 2.Caco-2細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，P-糖蛋白表達(dá)通過熒光免疫法驗(yàn)證;采用MTT法考察維拉帕米和地塞米松對Caco-2細(xì)胞活性的影響;使用流式細(xì)胞術(shù)考察地塞米松、維拉帕米對羅丹明123攝取的影響。使用免疫熒光與流式細(xì)胞術(shù)研究地塞米松、維拉帕米對P-糖蛋白表達(dá)的影響。

3、>　　 3.將Caco-2細(xì)胞接種于transwell板進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建單層細(xì)胞模型，用細(xì)胞電位儀、螢光黃及普奈洛爾轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)對模型進(jìn)行驗(yàn)證。建模成功后考察地塞米松、維拉帕米對阿米替林與去甲替林的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 4.396只昆明種雄性小鼠被隨機(jī)分成3組，經(jīng)單次或多次給藥后，研究地塞米松與維拉帕米對阿米替林與去甲替林中樞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在實(shí)驗(yàn)條件下，地塞米松、維拉帕米及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)分離良

4、好，色譜峰尖銳且半峰寬小于0.25s。一次進(jìn)樣的運(yùn)行時(shí)間小于4min。最低檢測限為10ng·mL-1。阿米替林與去甲替林在10～2500ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，方法準(zhǔn)確、靈敏、簡單。
　　 2.Caco-2細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)成功，熒光免疫法證實(shí)了Caco-2細(xì)胞中P-糖蛋白強(qiáng)表達(dá)。MTT法證實(shí)地塞米松、維拉帕米濃度小于100μmol·L-1時(shí)，對細(xì)胞活性無影響。Rh-123的攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0.01～25μmol·L-1范

5、圍內(nèi)，與空白對照組相比，地塞米松組降低了細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，降低的幅度為10～60％，熒光強(qiáng)度與濃度呈負(fù)相關(guān);而維拉帕米增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度（濃度＞0.1μmol·L-1），熒光強(qiáng)度的增加與劑量正相關(guān)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1～50μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，地塞米松組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于空白對照組(P＜0.05);維拉帕米組在0.1～50μmol·L-1范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度均顯著強(qiáng)于空白對照組(P＜0.05)。在較低濃度（0.01～0.1μmol·L

6、-1）時(shí)，地塞米松對P-gp的表達(dá)無影響;維拉帕米濃度為0.01μmol·L-1時(shí)，對P-gp表達(dá)無影響。
　　 3.顯微鏡下顯示Caco-2單層細(xì)胞排列緊密且完整，熒光黃及普萘洛爾跨膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)通透性低，而跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通路通透性良好。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了阿米替林與去甲替林是P-gp的弱型底物，地塞米松增加了阿米替林和去甲替林的外排速率（增加幅度為10％～60％)，而維拉帕米減少了阿米替林和去甲替林的外排速率（減少幅度為1

7、0％～20％）。
　　 4.在體動物實(shí)驗(yàn)表明地塞米松能減少阿米替林與去甲替林腦組織濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)值，減少程度大約為40～50％，而維拉帕米能增加阿米替林與去甲替林AUC值，增加程度大約為10％～50％。
　　 結(jié)論:
　　 地塞米松能增強(qiáng)P-糖蛋白的功能，同時(shí)誘導(dǎo)其表達(dá)，增加了阿米替林與去甲替林的外排速率，減少中樞分布，而維拉帕米能抑制P-糖蛋白功能，誘導(dǎo)其表達(dá)，總體表現(xiàn)為抑制了P-gp的外排速率