基于與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp相互作用的抗結(jié)核藥物耐藥機(jī)制研究.pdf

1、20世紀(jì)80年代后結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性明顯回升趨勢(shì)，其主要原因之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)。結(jié)核桿菌的高耐藥問題已成為新世紀(jì)結(jié)核病控制的難題之一。目前對(duì)耐多藥結(jié)核(MDR-TB)耐藥機(jī)制的研究主要集中在耐多藥分枝桿菌領(lǐng)域，較少從宿主角度考慮。結(jié)合抗腫瘤多藥耐藥機(jī)制的研究成果--即腫瘤多藥耐藥的發(fā)生主要是由于P-gp等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)藥物產(chǎn)生了外排作用。本課題通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩部分研究，從宿主的角度考察了不同抗

2、結(jié)核藥物在體外對(duì)P-gp的影響，以及抗結(jié)核藥物不同組合在不同給藥周期條件下在體內(nèi)對(duì)藥物的組織分布和不同組織mdr1α mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 目的：通過考察治療劑量的五種抗結(jié)核藥物利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)和左氧氟沙星(LVX)對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp功能和表達(dá)的影響，探討四種主要抗結(jié)核藥物與P-gp是否存在明顯相互作用；以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步選擇三種抗結(jié)核藥物研究不同組合對(duì)

3、藥物在昆明小鼠不同組織分布，以及對(duì)小鼠各組織mar1α mRNA表達(dá)水平的影響，初步探討宿主因素對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥的影響，以及臨床抗結(jié)核治療標(biāo)準(zhǔn)給藥方案的潛在耐藥因素。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞模型的建立及細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)，為四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-gp功能和表達(dá)的作用研究提供P-gp載體細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞。ECV304和Caco-2細(xì)胞均采用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)

4、培養(yǎng)；細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)驗(yàn)證。
　　 采用苯基溴化四氮唑藍(lán)法(MTT)，判斷各試驗(yàn)藥物的體外最大非細(xì)胞毒性劑量，保證試驗(yàn)過程中細(xì)胞的活性，并為四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-gp功能和表達(dá)的研究提供與細(xì)胞作用的安全濃度。
　　 2.羅丹明-123攝取實(shí)驗(yàn)研究藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp功能的影響以ECV304細(xì)胞作陰性對(duì)照細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，以RFP作為P-gp功能誘導(dǎo)的陽性對(duì)照，維拉帕米(

5、VER)作為P-gp功能抑制的陽性對(duì)照，分別考察四種抗結(jié)核藥物對(duì)經(jīng)典P-gp功能探針?biāo)幬?-羅丹明-123(Rh-123)攝取作用的影響，以此判斷P-gp功能的變化。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的影響以RFP作為P-gp表達(dá)上調(diào)的陽性對(duì)照，VER作為P-gp表達(dá)下調(diào)的陽性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別分析四種抗結(jié)核藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp表

6、達(dá)的影響。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1 mRSA表達(dá)以RFP作為MDR1 mRNA上調(diào)的陽性對(duì)照，VER作為MDR1mRNA下調(diào)的陽性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別分析四種抗結(jié)核藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 5.LC-MS/MS法測(cè)定昆明鼠血漿及各組織中三種抗結(jié)核藥物的濃度采用C4色譜柱(250mm×4.

7、6mm，5.0μm，Welch materials，USA)，流動(dòng)相為0.05％甲酸溶液-甲醇(v/v)梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL，采用ESI+多反應(yīng)選擇離子檢測(cè)(MRM)。
　　 6.三種抗結(jié)核藥不同給藥組合與不同給藥周期條件下在昆明鼠的血漿和組織分布情況昆明鼠168只，分為A組(空白組)、B組(INH alone組)、C組(RFP alone組)、D組(LVX alone組)、E組(IN

8、H+RFP組)、F組(LVX+RFP組)、G組(RFP+INH+LVX組)，每組24只，并隨機(jī)編號(hào)。腹腔注射給藥，每日1次，給藥體積為0.2ml，空白組給注射生理鹽水0.2ml，各藥物組給藥量分別為INH(45mg·kg-1)，RFP(67.5mg·kg-1)，LVX(45 mg·kg-1)。于第1次給藥后2小時(shí)，各組動(dòng)物取一半，分別眼眶取血后處死小鼠，快速摘取腦、肝、腎、肺、小腸等組織，全血采用肝素抗凝，6000 r·min-1離心1

9、0min后分離血漿，編號(hào)后于-70℃冰箱保存待測(cè)，組織樣本經(jīng)生理鹽水洗凈后，稱重，裝于小封口袋，編號(hào)后于-70℃保存待測(cè)；于第10次給藥后2小時(shí)，分別處死各組剩余動(dòng)物，分別采集上述樣本待測(cè)。通過測(cè)定血漿及各種組織中在給藥2h時(shí)的藥物濃度加以分析。
　　 7.三種抗結(jié)核藥不同給藥組合連續(xù)給藥10d對(duì)昆明鼠不同組織mdr1α mRNA表達(dá)水平的影響昆明鼠21只，體重30g左右。小鼠購回后均飼養(yǎng)3d適應(yīng)新環(huán)境，按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分成7組，

10、每組3只。分組及給藥方法“同上”。在第10d給藥后2 h將小鼠放血處死，快速取出腦、肺、腎、小腸組織，編號(hào)后置于液氮中保存待測(cè)。各器官組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞在正常條件下生長旺盛；Caco-2細(xì)胞P-gp高表達(dá)，可用于研究四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-gp功能和表達(dá)的影響；ECV304細(xì)胞P-gp低表達(dá)，適合作為陰性對(duì)照細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示五種抗結(jié)核藥及VER帶

11、藥培養(yǎng)3d，對(duì)Caco-2細(xì)胞的最大無毒濃度分別為：RFP100μmol/L，INH150μmol/L，LVX5μmol/L，EMB150μmol/L，PZA2001μmol/L，VER101μmol/L。在后續(xù)10d、20d、30d、40d、50d MTT實(shí)驗(yàn)中選擇藥物的濃度分別為：RFP10μmol/L，INH80μmol/L，LVX2μmol/L，EMB301μmol/L，PZA100μmol/L(各藥物濃度均接近人常規(guī)劑量給藥后

12、的血藥峰濃度)；VER為10μmol/L。最終的MTT結(jié)果顯示：各細(xì)胞存活率均大于90％。因此，各藥物濃度適用于研究長期含藥培養(yǎng)對(duì)P-gp功能和表達(dá)的影響。
　　 2.各研究藥物對(duì)Caeo-2細(xì)胞P-gp功能的影響：藥物干預(yù)1h時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、陽性誘導(dǎo)對(duì)照組(RFP)及陽性抑制對(duì)照組(VER)均明顯減少了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，揭示瞬時(shí)的藥物刺激能增強(qiáng)P-gp的外排功能，對(duì)干預(yù)藥物不具選擇性

13、。藥物干預(yù)3d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均明顯增加了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，說明隨著短期內(nèi)藥物干預(yù)時(shí)間延長，藥物干預(yù)轉(zhuǎn)為減弱P-gp的外排功能，同樣對(duì)干預(yù)藥物不具選擇性。藥物干預(yù)10d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組對(duì)P-gp的外排功能表現(xiàn)出差異，其中RFP、INH與EMB減少了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，增強(qiáng)了P-gp的外排功能，表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用；VER和

14、LVX增加了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，減弱了P-gp的外排功能，表現(xiàn)為抑制作用；而PZA與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異。藥物干預(yù)20d時(shí)，各藥物組與陽性對(duì)照組對(duì)Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的影響與干預(yù)10d時(shí)的結(jié)果趨勢(shì)一致。藥物干預(yù)30d時(shí)，各藥物組與陽性對(duì)照組對(duì)Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的影響與藥物干預(yù)10d和20d時(shí)的結(jié)果趨勢(shì)仍表現(xiàn)一致；其中VER和LVX仍表現(xiàn)為抑制作用(P<0.05)，但其增

15、加Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rh-123蓄積的相對(duì)量有所下降；INH、EMB和RFP仍表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用(P<0.05)。藥物干預(yù)40d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均明顯減少了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P<0.05)，全部表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用；且藥物干預(yù)50d時(shí)，各藥物組及陽性對(duì)照組與藥物干預(yù)40d時(shí)結(jié)果一致，也全部表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。
　　 3.各研究藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的影響：藥物干預(yù)1h時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核

16、藥物組、陽性誘導(dǎo)對(duì)照組(RFP)及陽性抑制對(duì)照組(VER)分別與陰性對(duì)照組比較，P-gp的表達(dá)量差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明瞬時(shí)(1h)的藥物干預(yù)對(duì)P-gp的表達(dá)量幾乎沒有影響；藥物干預(yù)3d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)(P<0.05)，各組的P-gp表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的40％左右，說明短期(3d)的藥物干預(yù)，可較明顯的抑制P-gp的表達(dá)，且這一過程對(duì)干預(yù)藥物不具明顯的選擇性。藥物干預(yù)1

17、0d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)量表現(xiàn)出差異，其中INH組和EMB組的P-gp表達(dá)量與陽性誘導(dǎo)對(duì)照組(RFP)一致，約為陰性對(duì)照組的4～7倍，表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用；LVX組與陽性抑制對(duì)照組(VER)一致，其P-gp表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的30％，表現(xiàn)出抑制作用；而PZA與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異。藥物干預(yù)20d時(shí)，各藥物組及陽性對(duì)照組對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp表達(dá)量的影響與干預(yù)10d時(shí)的結(jié)果趨勢(shì)

18、一致，其中INH組租EMB組P-gp表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的4倍，LVX組P-gp的表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的50％，而PZA與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異。藥物干預(yù)30d、40d、50d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均明顯增加了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)量(P<0.05)，表現(xiàn)出不具藥物選擇性的誘導(dǎo)作用。
　　 4.各研究藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)的影響：藥物干預(yù)1h時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及V

19、ER組與陰性對(duì)照組比較，MDR1mRNA的表達(dá)量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物干預(yù)3d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，各組的MDR1 mRNA表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的30％左右。藥物干預(yù)10d時(shí)，INH、EMB及陽性誘導(dǎo)對(duì)照組RFP均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表達(dá)量為陰性對(duì)照組的12倍左右，

20、為陽性誘導(dǎo)組RFP的90％；LVX與陽性抑制對(duì)照組VER一致，下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，其MDR1 mRNA表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的30％；而PZA與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異。藥物干預(yù)20d時(shí)，各藥物組及陽性對(duì)照組對(duì)Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA表達(dá)量的影響與干預(yù)10d時(shí)的結(jié)果趨勢(shì)一致。藥物干預(yù)30d時(shí)，四個(gè)抗結(jié)核藥物組、RFP組及VER組均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA的表達(dá)(

21、P<0.05)，表現(xiàn)出不具藥物選擇性的上調(diào)作用；且藥物干預(yù)40d和50d時(shí)，各藥物組與陽性對(duì)照組與干預(yù)30時(shí)結(jié)果趨勢(shì)一致，同樣表現(xiàn)出不具藥物選擇性的上調(diào)作用?？傮w上，各研究藥物在各時(shí)間周期對(duì)MDR1 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響趨勢(shì)基本一致。
　　 5.LC-MS/MS法測(cè)定昆明鼠血漿及不同組織中三種抗結(jié)核藥物的濃度：所建立的LC-MS/MS法專屬性強(qiáng)、靈敏準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定血漿和組織樣本中INH、RFP和LV

22、X的濃度。
　　 6.三種抗結(jié)核藥不同給藥組合與不同給藥周期條件下在昆明鼠的血漿和組織分布結(jié)果：各給藥組在血漿中的藥物濃度均表現(xiàn)為連續(xù)給藥10d明顯比單次給藥高；而各給藥組在腦、肝、腎組織的藥物分布，表現(xiàn)為連續(xù)給藥10d藥物濃度均明顯低于單次給藥，并且LVX能明顯拮抗所合用藥物組織分布減少的趨勢(shì)。各給藥組在小腸組織的藥物分布，則表現(xiàn)為給藥10d藥物濃度與單次給藥無明顯差異。
　　 7.三種抗結(jié)核藥不同給藥組合連續(xù)給藥10

23、d對(duì)昆明鼠不同組織mdr1α mRNA表達(dá)水平的影響：對(duì)比空白組，同一藥物試驗(yàn)組連續(xù)腹腔注射給藥10d后對(duì)小鼠不同組織mdr1α mRNA影響不同，而不同藥物試驗(yàn)組對(duì)小鼠同一組織mdr1α mRNA的影響也不同；總體趨勢(shì)為INH組、RFP組、INH+RFP組均能明顯上調(diào)小鼠腦、腎和小腸組織的mdr1α mRNA水平，尤其是對(duì)腦組織和小腸組織中mdr1α mRNA水平的上調(diào)幅度達(dá)到5-70倍，對(duì)腎組織也達(dá)到8-12倍；而LVX則表現(xiàn)為下調(diào)

24、小鼠腦和腎組織的mdr1α mRNA水平，倍數(shù)為0.8-0.9，且LVX+RFP組較RFP組以及RFP+INH-LVX組較INH+RFP組對(duì)小鼠腦、腎和小腸組織的mdr1α mRNA水平上調(diào)程度均有顯著降低；但各藥物組對(duì)肺組織mdr1α mRNA水平均表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)，這可能與肺組織本身P-gp分布較少有關(guān)，肺組織僅在其分泌細(xì)胞有P-gp分布，而本實(shí)驗(yàn)是測(cè)定的全肺組織，因此其整體mdr1α mRNA水平較低，藥物對(duì)其影響則不明顯。

25、　　 結(jié)論：
　　 1.體外細(xì)胞試驗(yàn)初步證實(shí)INH和EMB為P-gp的誘導(dǎo)劑，INX為P-gp的抑制劑，PZA與P-gp無明顯的相互作用。并發(fā)現(xiàn)長期藥物干預(yù)時(shí)(>30d)，對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp的功能和表達(dá)的影響表現(xiàn)出無藥物選擇性的上調(diào)作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。
　　 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期用藥(10d)過程中，不同藥物組合對(duì)藥物的組織分布以及組織mdr1α mRNA表達(dá)水平存在明顯影響，整體趨勢(shì)為上調(diào)組織mdr1α