戊己丸不同配伍的腸吸收特征及與P-gp相互作用研究.pdf

1、1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 中藥復(fù)方配伍是中醫(yī)用藥的一大特色和優(yōu)勢(shì)，了解其配伍規(guī)律對(duì)臨床辨證施治有重要的指導(dǎo)意義。中藥復(fù)方多以口服形式入藥，藥物在腸道中的吸收是決定藥物生物利用度和影響藥物發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因素。本研究以戊己丸為例，利用正交設(shè)計(jì)的方法，從腸吸收角度，通過監(jiān)測(cè)中藥復(fù)方組成中藥的代表成份小檗堿（Ber）、巴馬?。≒al）、吳茱萸堿（Evo）、吳茱萸次堿（Rut）、芍藥苷（Peo），以其數(shù)、量、相互比例為著眼點(diǎn)，研究戊己丸不同

2、比例的配伍腸道吸收過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及組成藥物的貢獻(xiàn)度、貢獻(xiàn)形式等，并以數(shù)學(xué)方程和圖解對(duì)其進(jìn)行描述，借以探討中藥復(fù)方的配伍原理以及科學(xué)性。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1戊己丸組方及其配伍的腸外翻吸收研究方法：采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表，將戊己丸組方中的黃連、制吳茱萸、炒白芍作為3因素，各因素的3個(gè)不同劑量作為實(shí)驗(yàn)的水平數(shù)，研究戊己丸9個(gè)不同配比及其相應(yīng)的單味藥物在腸道中的吸收。采用腸外翻生物模型，以戊己丸中代表成份Ber

3、、Pal、Evo、Rut、Peo為檢測(cè)對(duì)象，用HPLC檢測(cè)五個(gè)成分在單味藥中的經(jīng)時(shí)吸收量，用LC-MS同時(shí)檢測(cè)戊己丸配伍中五個(gè)代表成份的變化。通過單因素方差分析（ANOVA）、正交設(shè)計(jì)的方差分析及歸一化加權(quán)綜合評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：黃連提取物中Ber和Pal在腸道吸收過程中為零級(jí)吸收，其R2>0.9，在不同劑量時(shí)Kα顯示兩者為被動(dòng)擴(kuò)散，各腸段吸收總趨勢(shì)為空腸>回腸>結(jié)腸；制吳茱萸提取物中Evo和Rut在腸道

4、中為零級(jí)吸收，R2>0.9，Evo在小腸各段、Rut在空腸、回腸中均表現(xiàn)為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，Rut在結(jié)腸中Ka隨劑量增加而增加，表現(xiàn)為被動(dòng)擴(kuò)散形式，低劑量時(shí)結(jié)腸吸收少于空腸、回腸，高劑量時(shí)結(jié)腸多于空腸、回腸；Peo吸收為零級(jí)吸收，R2>0.9，吸收形式以被動(dòng)擴(kuò)散為主，不同腸段的吸收為空腸>回腸>結(jié)腸。
　　 用LC-MS結(jié)合快速分離色譜柱，建立同時(shí)測(cè)定戊己丸中5個(gè)性質(zhì)不同化合物的分析檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了在較短時(shí)間內(nèi)（t<3.5min）同時(shí)分

5、離目標(biāo)檢測(cè)成分；同時(shí)對(duì)方中5個(gè)化學(xué)成分均采用ESI正離子模式選擇性離子檢測(cè)法，排除了其他雜質(zhì)的干擾，方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。正交設(shè)計(jì)研究顯示戊己丸中5個(gè)代表成份在不同配伍比例時(shí)在腸道的吸收動(dòng)力學(xué)不同。在空腸、回腸、結(jié)腸中5個(gè)代表成分的最佳吸收組合分別為，Ber（12:6:3、12:6:3、12:2:3），Pal（12:1:12、12:1:12、12:2:12），Evo（6:6:3、6:6:3、6:6:3），Ru

6、t（12:6:12、12:6:3、12:6:3），Peo（6:2:6、6:2:6、6:6:6），相同成分在腸道不同部位的吸收趨勢(shì)大致相同，但不同成分之間的吸收趨勢(shì)變化較大。用多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)分析方法進(jìn)行方劑配伍比例的優(yōu)選，首先將分散的數(shù)據(jù)歸一化，使其具有可比性。然后針對(duì)指標(biāo)間的重要性差異給出各指標(biāo)的權(quán)重，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)戊己丸組方中的君臣佐使，確定Ber和Pal的權(quán)重為6，Evo、Rut和Peo的權(quán)重為4，給出綜合評(píng)分進(jìn)行正交統(tǒng)計(jì)。結(jié)果為黃連在

7、各腸段吸收貢獻(xiàn)度最大，確定了其君藥地位，制吳茱萸和炒白芍次之，為臣藥，其吸收最優(yōu)配伍比例為黃連：制吳茱萸：炒白芍=6:3:6。
　　 2.2戊己丸單方及優(yōu)選配伍組方在Caco-2細(xì)胞中的吸收研究方法：利用Caco-2細(xì)胞類似小腸上皮細(xì)胞的特性，研究中藥提取物及其配伍在細(xì)胞中的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)特征。攝取實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞種于24孔板，加藥1h后細(xì)胞勻漿，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物含量；轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種到Millicell小室膜上，待細(xì)胞具有極性、分化完成

8、、完整性好后進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將藥物加入AP或BL側(cè)，檢測(cè)另一端小室內(nèi)的藥物吸收/外排量的變化。
　　 結(jié)果：細(xì)胞生長(zhǎng)21天堿性磷酸酶活力AP側(cè)為BL側(cè)的2倍以上（P<0.05），說明細(xì)胞具有極性，分化完成：熒光素鈉Papp值在4.4×10-7cm·sec-1，2h其透過率在0.7％，TEER值達(dá)到600Ω·c㎡（7-8d），證明細(xì)胞完整性較好，可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。
　　 Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了Ber、Pa

9、l、Peo以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，Pb-a/Pa-b比例均在1左右，Evo、Rut以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，Evo的Pb-a/Pa-b比例<0.5，Rut的Pb-a/Pa-b比例<0.8；配伍6:1:6時(shí)Ber、Pal、Evo的攝取和外排均有所增加，Ber吸收減少，Rut攝取、吸收和外排均不同程度降低。配伍12:2:3和12:1:12時(shí)各代表成份吸收變化趨勢(shì)大致相似，但在12:1:12配伍中Ber吸收增加、Evo細(xì)胞攝取量增多，這可能是引起兩個(gè)

10、配伍組產(chǎn)生相同藥效的同時(shí)各有側(cè)重點(diǎn)的原因。
　　 2.3戊己丸單方與P-gp相互作用研究方法：Ver抑制P-gp實(shí)驗(yàn)，采用腸外翻法，在腸外加入含有或不含有Ver（100μM）的測(cè)試藥液，比較Ver對(duì)戊己丸組成單方中成分的吸收變化影響；Rho123外排實(shí)驗(yàn)，大鼠按實(shí)驗(yàn)分組分別給藥5天，用腸外翻模型研究對(duì)Rho123的外排改變情況。
　　 結(jié)果：Ber、Pal、Evo在加入Ver后，在腸道各段吸收沒有明顯改變，Pal在加入V

11、er后吸收略有增加，尤其以結(jié)腸和回腸吸收增加較多，Peo在回腸中吸收比不加Ver時(shí)有顯著增加（P<0.05），空腸和結(jié)腸改變不明顯。對(duì)Rho123外排影響，提前服用Ver后，Rho123的外排顯著減少（P<0.01），說明Ver抑制了P-gp，黃連組在空腸中對(duì)Rho123的外排也顯著減少（P<0.05），回腸中外排有減少趨勢(shì)。炒白芍組在回腸中Rho123外排顯著增加（P<0.01），其余各組對(duì)Rho123外排沒有明顯影響。
　　

12、 2.4戊己丸單方及不同配伍對(duì)MDR1-mRNA表達(dá)的影響方法：在Caco-2細(xì)胞中加入含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)2d，收集細(xì)胞后用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR對(duì)MDR1-mRNA進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：配伍6:1:6、12:2:3、12:1:12以及相同劑量黃連提取物單味藥物均可以降低MDR1-tuRNA的表達(dá)，制吳茱萸提取物及炒白芍提取物則可以誘導(dǎo)MDR1-mRNA表達(dá)，使其表達(dá)量增加。
　

13、　 3.結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)利用腸外翻模型和Caco-2細(xì)胞模型，研究戊己丸組方中單味藥物和不同配=6:3:6為伍下的代表成份吸收變化情況，結(jié)果顯示戊己丸中代表成份在腸道中的吸收機(jī)制不同，不同配伍比例時(shí)吸收變化較大，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析最終得出黃連：制吳茱萸：炒白芍=6:3:6為最佳吸收配比，同時(shí)證明了黃連在方中的貢獻(xiàn)度最大，確定其君藥地位，制吳茱萸和炒白芍次之，為臣藥。通過研究戊己丸單方與配伍對(duì)P-gp的相互作用，證明戊己丸單方與不同