生物炭對煙草類胡蘿卜素代謝的影響及LCY-b基因過表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、為闡明添加生物炭對煙草類胡蘿卜素代謝的影響機(jī)制，本試驗以煙草品種K326為材料，在大田試驗中設(shè)置不同的生物炭處理，從煙株發(fā)育過程中葉片類胡蘿卜素積累動態(tài)、類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)和烤后樣中性致香物質(zhì)三個方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在此基礎(chǔ)上，以類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點酶LCY-b為切入點，通過同源克隆的方法獲得煙草品種K326LCY-b基因全長序列，利用in-fusion方法成功構(gòu)建了LCY-b基因過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化

2、煙草植株，得到LCY-b過表達(dá)陽性植株共6株。將T0代陽性植株進(jìn)行大田種植，進(jìn)一步探究LCY-b基因?qū)煵蓊惡}卜素代謝及烤后樣中性致香物質(zhì)的影響，為煙草類胡蘿卜素代謝的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.不同生物炭肥施用量對煙草類胡蘿卜素代謝影響的分析結(jié)果表明：隨著煙葉成熟，類胡蘿卜素合成相關(guān)基因（PSY、ZDS、LCY-b）表達(dá)逐漸減弱，降解相關(guān)基因（CCD1）表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與打頂后類胡蘿卜素含量逐漸下降的結(jié)果一致

3、。煙葉成熟后期，添加生物炭的處理類胡蘿卜素積累量較多，其中T1（300kg?hm-2）處理的類胡蘿卜素各組分含量在打頂后一直保持在較高水平。RT-PCR分析結(jié)果顯示：T1（300kg?hm-2）和T2（600kg?hm-2）處理中類胡蘿卜素合成及降解相關(guān)基因的表達(dá)量相對較強(qiáng)，說明適量添加生物炭肥對煙葉類胡蘿卜素的合成和降解均有明顯的促進(jìn)作用，整體上減緩了類胡蘿卜素含量下降趨勢，提高了成熟期煙葉類胡蘿卜素積累量。煙葉調(diào)制后，T1處理的類胡

4、蘿卜素降解產(chǎn)物含量最高，未添加生物炭肥的處理含量最低。以上結(jié)果說明，適量添加生物炭能夠增強(qiáng)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶活性，有利于成熟期煙葉類胡蘿卜素的積累及調(diào)制后中性致香物質(zhì)的形成。
　　2.采用同源克隆的方法獲得煙草LCY-b基因全長序列1557bp，并對其進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。序列分析表明：K326LCY-b基因包含一個1503bp的開放讀碼框（ORF），編碼500個氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為56.05KDa，理論等電點（pI

5、）為6.68。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。
　　3.利用in-fusion方法成功構(gòu)建LCY-b過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草植株，獲得LCY-b過表達(dá)陽性植株。分子檢測證明LCY-b基因在煙草基因組中成功實現(xiàn)了整合和轉(zhuǎn)錄。過表達(dá)陽性植株的qPCR檢測結(jié)果表明：部分轉(zhuǎn)基因陽性植株LCY-b基因的表達(dá)量顯著高于K326對照。相應(yīng)地，類胡蘿卜素組分中的β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)所占比例增加，而葉黃素所占比