草莓類胡蘿卜素基因psy、pds遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、草莓（Fragaria×ananassa Duch.）屬薔薇科多年生草本植物，果實紅嫩多汁且富含營養(yǎng)，素有‘水果皇后’的美稱。近年來，隨著草莓經(jīng)濟(jì)價值的逐步升高，其果實品質(zhì)開始受到越來越多人的重視。類胡蘿卜素不僅是果實品質(zhì)的重要指標(biāo)，還是維生素A的前體，在防癌抗癌方面起到重要作用，然而，目前主栽的草莓品種中類胡蘿卜素含量普遍偏低，因此，設(shè)法提高草莓中類胡蘿卜素的含量顯得十分必要。
　　八氫番茄紅素合成酶（PSY）和八氫番茄紅素脫氫

2、酶（PDS）是類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶。隨著 psy、pds基因在類胡蘿卜素生理機(jī)制研究中的不斷深入，使之應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)控草莓中類胡蘿卜素含量成為可能。本研究以草莓為材料，在優(yōu)化草莓再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，開展草莓psy、pds基因轉(zhuǎn)化草莓的研究，主要結(jié)果如下：
　　1.建立了草莓葉片高頻離體再生體系
　　以‘福莓一號’，‘紅實美’兩個草莓品種為材料，草莓葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，通過添加3種植物激

3、素6-BA，IBA和2,4-D，探討不同植物激素組合和配比對草莓葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：‘福莓一號’葉片誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-12,4-D，誘導(dǎo)率可達(dá)85.7％?！t實美’葉片誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA，誘導(dǎo)率可達(dá)81.9%。
　　2.構(gòu)建了草莓psy、pds基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301psy-pds

4、>　　依據(jù)已報道的草莓psy、pds基因全長序列，設(shè)計特異引物，分別克隆psy、pds基因的開放閱讀框，然后將psy、pds基因的開放閱讀框分別插到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301和pBI121的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301psy和pBI121pds，接著，將帶有啟動子、終止子、gusA基因和pds基因的片段引入pCAMBIA1301psy，最終獲得psy、pds基因植物表達(dá)載體pCA

5、MBIA1301psy-pds。
　　3.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系并得到部分轉(zhuǎn)基因植株
　　通過確定草莓葉片不定芽誘導(dǎo)過程中潮霉素（Hyg）和羧芐青霉素（Carb）的選擇壓，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌液適宜的侵染濃度為OD600=0.2，侵染時間10min最佳，預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間均以48h為宜，潮霉素和羧芐青霉素濃度分別為5mg·L-1和500mg·L-1時，轉(zhuǎn)化效果較好。本次試驗共獲得11株

6、草莓抗性植株，經(jīng) PCR檢測表明，其中有9株為轉(zhuǎn) psy、pds基因植株。
　　4.建立了UPLC測定草莓果實中類胡蘿卜素含量的標(biāo)準(zhǔn)體系
　　通過對不同提取劑、提取方法的篩選，優(yōu)化草莓果實類胡蘿卜素的提取條件；通過確定吸收波長、色譜條件以及重復(fù)性、精密度、回收率試驗，建立類胡蘿卜素超高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)分析體系。結(jié)果表明，以丙酮:石油醚=1:2作為提取劑，皂化提取草莓果實中類胡蘿卜素，同時采用ACQUITY UPLC BEH