番茄紅素環(huán)化酶基因在煙草類胡蘿卜素合成中的作用研究.pdf

1、隨著環(huán)境的日益惡化，水資源緊缺以及土壤鹽堿化成為了世界性的問題，培育抗逆的植物品種已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。類胡蘿卜素是植物體內(nèi)一種重要的色素，作為植物光合系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的重要成員，在植物生長發(fā)育和抵御逆境的過程中起著重要的作用。番茄紅素環(huán)化酶，包括ε番茄紅素環(huán)化酶和β番茄紅素環(huán)化酶，它們位于高等植物類胡蘿卜素合成通路的分支點(diǎn)上，是類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，催化番茄紅素向α或β類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化。
　　本文分別對煙草中ε番茄紅素環(huán)化

2、酶和β番茄紅素環(huán)化酶基因進(jìn)行克隆，并對其遺傳背景和表達(dá)模式進(jìn)行分析，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）和轉(zhuǎn)基因技術(shù)對兩個基因在類胡蘿卜素合成及抗逆中的作用進(jìn)行了詳細(xì)的研究，主要研究內(nèi)容如下：
　?。?）采用同源克隆的方法得到普通煙草Ntε-LCY基因，設(shè)計跨內(nèi)含子保守引物從煙草DNA組中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用凝膠電泳和毛細(xì)管電泳技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離分析，發(fā)現(xiàn)普通煙草基因組內(nèi)存在兩個Ntε-LCY基因拷貝，命名為Ntε-LCY1和N

3、tε-LCY2；遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明Ntε-LCY1和Ntε-LCY2分別來源于林煙草和絨毛狀煙草，兩個基因編碼區(qū)核酸序列相似度高達(dá)97％，氨基酸序列高達(dá)95%?；虮磉_(dá)模式分析結(jié)果顯示 Ntε-LCY基因在各個組織器官中都有表達(dá)，但在葉中表達(dá)量最高，而且該基因受低溫弱光條件誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示 Ntε-LCY1成熟蛋白定位在葉綠體中。利用 VIGS在本氏煙草中對ε-LCY基因功能進(jìn)行了初步研究，利用HPLC-UV對煙草代謝物類

4、胡蘿卜素進(jìn)行分離檢測，發(fā)現(xiàn)ε-LCY基因的表達(dá)抑制增加了β-分支類胡蘿卜素的含量，降低了α分支類胡蘿卜素的含量，煙草體內(nèi)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)量也顯著提高，同時改善了煙草對光抑制的抵御能力。借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過RNA干擾（RNAi）和過量表達(dá)煙草中的Ntε-LCY基因，進(jìn)一步的研究了Ntε-LCY在植物中的生理功能。在Ntε-LCY RNAi植株中提高了類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)量和β分支類胡蘿卜素的含量。在鹽和干旱脅迫條件下，N

5、tε-LCY RNAi轉(zhuǎn)基因植株具有較高的相對含水量和較少的活性氧含量。利用UPLC-MS/MS對脅迫前后Ntε-LCY RNAi轉(zhuǎn)基因及對照煙草中ABA含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙株中具有較高的ABA含量，充分說明Ntε-LCY表達(dá)抑制顯著提高了植物對高鹽和干旱的適應(yīng)能力。相反地Ntε-LCY過量表達(dá)則降低了煙株的抗鹽抗旱能力。
　?。?）采用同源克隆的方法從普通煙草中克隆得到Ntβ-LCY基因，并分析了其遺傳背景，煙草 Ntβ-

6、LCY基因與茄科植物的蛋白相似度高達(dá)89%以上，與模式植物擬南芥相似度高達(dá)77%，且與祖先種煙草絨毛煙草氨基酸序列相似性高達(dá)99.8%，表明β-LCY基因是一個進(jìn)化較為保守的基因，同時也推斷克隆的Ntβ-LCY基因可能來源于絨毛狀煙草。表達(dá)模式分析結(jié)果表明該基因在煙株生理作用比較旺盛的嫩葉中具有較高的表達(dá)量，且易于受植物激素和逆境誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位在葉綠體中。利用煙草脆裂病毒（TRV）介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，初步探討

7、了煙草β-LCY基因生物學(xué)功能，煙草中β-LCY基因表達(dá)抑制，使煙草葉片嚴(yán)重黃化，植株生長發(fā)育不良，矮化明顯，類胡蘿卜素及葉綠素含量急劇減少，并導(dǎo)致光合作用能力下降。由于β-LCY沉默導(dǎo)致顯著的表型特征，所以該研究為TRV VIGS提供了良好的可選參照基因。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用RNA干擾和過量表達(dá)的方法，進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能。在Ntβ-LCY RNAi轉(zhuǎn)基因煙草中，Ntβ-LCY基因的沉默使煙草出現(xiàn)嚴(yán)重的白化現(xiàn)象，嚴(yán)重者則會在苗

8、期逐漸死亡。定量PCR及代謝分析結(jié)果顯示，Ntβ-LCY基因的表達(dá)抑制嚴(yán)重的影響了類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和類胡蘿卜素物質(zhì)的正常合成，并且影響了信號分子ABA的合成，顯著降低了植物抵御逆境的能力。過量表達(dá)Ntβ-LCY基因，轉(zhuǎn)基因煙草沒有明顯的可視表型，定量PCR和代謝結(jié)果表明，該基因的過量表達(dá)提高了類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)和類胡蘿卜素及葉綠素含量。在鹽和干旱逆境脅迫條件下，Ntβ-LCY過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草能保持較高的體內(nèi)水含