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文檔簡介
1、背景和目的:
慢性下腰痛是目前最常見的疾病之一,并成為致殘的重要原因。它已造成極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。慢性下腰痛的主要原因是椎間盤退變。作為最大的無血管器官,髓核和內(nèi)層纖維環(huán)所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)是通過軟骨終板(CEP)的擴(kuò)散提供的。軟骨終板是位于椎間盤上下緣薄薄一層厚度小于1毫米軟骨,在脊柱局部的生物力學(xué)和生化功能中扮演非常重要的角色。軟骨終板的退行性變可導(dǎo)致低養(yǎng)分供應(yīng)、低氧張力、乳酸堆積,從而誘導(dǎo)椎間盤變性。因此,軟骨終板退變與
2、椎間盤變性和下腰痛息息相關(guān)。
椎體終板及軟骨下骨在磁共振成像(MRI)上信號強(qiáng)度的變化是脊柱退行性疾病中的一種常見現(xiàn)象。1988年,Modic總結(jié)了這些變化,稱他們?yōu)镸odic改變(Modicchanges,MCs),并分為三種類型。Ⅰ型,在T1加權(quán)像上顯示為低信號,T2加權(quán)像上相對正常終板顯示為高信號,組織病理學(xué)表現(xiàn)為組織水腫和血管化增加;Ⅱ型,在T1加權(quán)像上為高信號,T2加權(quán)像上表現(xiàn)為等信號或輕度高信號,組織病理學(xué)表現(xiàn)為紅
3、骨髓被黃骨髓取代;Ⅲ型,在T1加權(quán)像及T2加權(quán)像上均表現(xiàn)為低信號,組織病理學(xué)表現(xiàn)為骨質(zhì)硬化。盡管Modic改變的原因和病理生理學(xué)尚不清楚,但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為炎癥介質(zhì)可能在軟骨終板退化中起著重要的作用。Crock認(rèn)為髓核中的炎癥因子彌漫可能導(dǎo)致軟骨終板的炎癥反應(yīng),從而繼發(fā)退變。在兩個(gè)臨床研究中發(fā)現(xiàn),化學(xué)髓核溶解術(shù)后鄰近終板發(fā)生了Modic改變。Ohtori等發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子(TNF)陽性的免疫反應(yīng)性細(xì)胞在伴有Modic改變的軟骨終板明顯比
4、MRI正常的軟骨終板多。然而,到目前為止,關(guān)于軟骨終板變性的炎癥機(jī)制的研究還很少。
基于上述的觀察,我們假設(shè)IL-1β參與軟骨終板退變中ADAMTS-5的表達(dá),且通過NF-κB途徑上調(diào)終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5表達(dá)。通過以下實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)假設(shè):分析伴Modic改變的人腰椎軟骨終板中ADAMTS-5的表達(dá)水平及其與IL-1β表達(dá)的相關(guān)性;通過牛終板軟骨細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),研究IL-1β對終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5表達(dá)的刺激作
5、用,及其調(diào)控機(jī)制。
方法:
1. 使用geNorm、 NormFinder和BestKeeper三種軟件篩選出在Modic改變(MCs)腰椎軟骨終板細(xì)胞中表達(dá)最為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參,對qRT-PCR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
所有腰椎軟骨標(biāo)本選自各種腰椎疾患而行椎體間融合術(shù)的患者。軟骨終板有MCs的患者納入到MCs組,沒有MCs的歸為對照組。MCs組和對照組分別有來自12個(gè)患者的樣本。兩組間患者的的年齡、性別相匹配,
6、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從既往文獻(xiàn)中常用的管家基因及關(guān)于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)中選取12個(gè)備選基因。終板軟骨的RNA提取依照Untergasser所述方法進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄采用ReverseTRanscription System試劑金Reverse Transcription System。 qRT-PCR采用GoTaqqRCP Master Mix試劑盒操作完成。每個(gè)樣本Ct值的數(shù)據(jù)分析采用3個(gè)基于微軟Excel平臺的宏程序:即geN
7、orm,NormFinder和BestKeeper。這些統(tǒng)計(jì)算法被用來評估12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,并確定Modic改變腰椎軟骨終板細(xì)胞中最適合作內(nèi)參的管家基因,對qRT-PCR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
2. 確定腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達(dá)的變化及其與IL-1β的相關(guān)性
所有腰椎退行性軟骨終板標(biāo)本選自因伴Modic改變的下腰痛疾患而行椎體間融合術(shù)的患者,納入到MCs組。沒有下腰痛病史而因胸腰椎爆裂性骨折需病椎和相鄰
8、椎間盤切除并植骨重建的患者納入到對照組。組織學(xué)分析伴Modic改變的軟骨終板(CEP)中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)的變化。RNA提取和qRT-PCR技術(shù)分析軟骨組織退變相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)、ADAMTS和IL-1β的mRNA在MCs組和對照組兩者間的表達(dá)差異。免疫組織化學(xué)方法研究兩組CEP中ADAMTS-4,ADAMTS-5和IL-1β各自的免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。用Spearman相關(guān)系數(shù)(Spearmanρ test)方法,從mRNA表達(dá)及免
9、疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的百分率兩個(gè)方面,分析腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達(dá)與IL-1β之間的相關(guān)性。
3. 通過牛終板軟骨細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),明確IL-1β能促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá),并通過NF-κB信號通路來調(diào)控ADAMTS-5的表達(dá)
用qRT-PCR技術(shù),免疫細(xì)胞化學(xué)方法,Western Blot等多種分子生物技術(shù),檢測IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5表達(dá)的刺激效應(yīng)。應(yīng)用Western Blo
10、t分析IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞的NF-κB信號通路的激活作用。并通過應(yīng)用NF-κB抑制劑SN50阻斷IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá)的刺激,反向證實(shí)IL-1β通過NF-κB信號通路上調(diào)ADAMTS-5的表達(dá)。
結(jié)果:
1. 12個(gè)備選內(nèi)參基因的Ct值范圍為從17.6(18S rRNA)到33.5(ACTB)。在GeNorm分析中,M值最小的為SDHA和B2M(0.45),因此它們是表達(dá)水平最穩(wěn)定的兩個(gè)
11、基因。按照表達(dá)水平穩(wěn)定性從最高到最低進(jìn)行排序,具體順序?yàn)镾DHA=B2M>LDHA>TBP>GUSB>GAPDH>IPO8>HMBS>ACTB>HPRT1>18SrRNA>RPL13A。在NormFinder分析中,所有樣本中最穩(wěn)定的基因是LDHA,其M值為0.102,隨后依次為SDHA、 B2M、GUSB、GAPDH、IPO8、HMBS、ACTB、TBP、18S rRNA、HPRT1和RPL13A。在BestKeeper分析中,SDH
12、A和ACTB的CV±SD值最小,因此被認(rèn)為是所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定的兩個(gè)基因。SDHA是所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定的單個(gè)基因,而SDHA、B2M和LDHA則是最佳的聯(lián)合內(nèi)參基因選擇。
2. MCs組表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)纖維化、硬化,以及軟骨細(xì)胞密度顯著降低。并可觀察到細(xì)胞肥大、集群和呈現(xiàn)多種細(xì)胞形態(tài)。番紅O-固綠染色顯示MCs組PG含量明顯減少。細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)水平的qRT-PCR檢測中, MC組的Ⅱ型膠原的mRNA表達(dá)
13、水平較對照組明顯降低(P<0.05);MC組中ADAMTS-5mRNA表達(dá)與對照組相比顯著增加(P<0.05)。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,MC組ADAMTS-5免疫檢測陽性的細(xì)胞百分比明顯高于對照組(P<0.01)。而MC組中ADAMTS-4mRNA表達(dá)水平和免疫檢測陽性的細(xì)胞百分率只較對照組稍微增加而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在mRNA表達(dá)及免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的百分率兩個(gè)方面,Spearman相關(guān)系數(shù)(Spearmanρ test)分析均證實(shí)腰椎軟骨終
14、板退變中IL-1β表達(dá)增強(qiáng)與ADAMTS-5高水平表達(dá)之間呈正相關(guān)。
3. IL-1β能上調(diào)牛終板軟骨細(xì)胞的ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達(dá)水平。經(jīng)IL-1β(10 ng/mL)作用48小時(shí)后,RT-PCR和Western Blot分別顯示牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)IL-1β作用以后,ADAMTS-5蛋白陽性的牛終板軟骨細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞內(nèi)ADAMTS
15、-5蛋白的熒光強(qiáng)度較與對照組顯著增強(qiáng)。在(10 ng/mL)IL-1β作用15min后,牛終板軟骨細(xì)胞的p-p65的蛋白濃度明顯升高, IκB-α的蛋白濃度明顯降低,而p65在始終基本保持不變。IL-1β對牛終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5表達(dá)的刺激作用可以被NF-κB抑制劑SN50(50微克/毫升)有效阻斷。
結(jié)論:
1. 這是第一個(gè)為確保腰椎終板軟骨細(xì)胞中基因表達(dá)水平評估的可靠性而選擇合適內(nèi)參基因的研究。我們的研究發(fā)
16、現(xiàn)在所有樣本中,表達(dá)最穩(wěn)定的基因是SDHA,聯(lián)合采用SDHA、B2M和LDHA作為內(nèi)參基因,可以獲得更為精準(zhǔn)的結(jié)果。
2. 伴Modic改變的腰椎終板軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5mRNA表達(dá)水平較正常軟骨終板有顯著增加,而ADAMTS-4表達(dá)水平無明顯改變。ADAMTS-5mRNA表達(dá)水平與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān),提示IL-1β可能選擇性地上調(diào)終板軟骨細(xì)胞ADAMTS-5的表達(dá)。
3. 我們的研究首次證實(shí),IL-1β可
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