感染、缺血等損傷對腰椎終板及腰椎間盤退變的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　作為人體中軸骨的主要承重結(jié)構(gòu)，腰椎在脊柱的各項活動中常需處于壓縮、拉伸、側(cè)彎或扭曲等多種復(fù)雜的運(yùn)動狀態(tài)中，其損傷及退變是人群常見的疾病之一，約60％成人及30％青少年有下腰痛(LBP)病史。既往研究顯示下腰痛與椎間盤退行性疾病密切相關(guān)，而近年來的研究則提出腰椎終板Modic改變是LBP的危險因素。Modic改變根據(jù)MRI信號變化將退變終板分為3種亞型:Ⅰ型Modic改變表現(xiàn)為終板在T1像上信號降低，T2像信號增高，提示

2、急性炎癥，骨組織輕微損傷及微骨折;Ⅱ型Modic改變表現(xiàn)為T1及T2像信號均增高，提示終板損傷、炎性改變及組織脂肪變;Ⅲ型Modic改變則表現(xiàn)為終板區(qū)域信號在T1及T2像均減低，提示區(qū)域骨化。Modic改變的人群整體發(fā)病率約為5.8％，其發(fā)生率及影響面積隨年齡增大而升高，以單純Ⅱ型Modic改變最為多見(64.2％)，其次為Ⅰ/Ⅱ型混合(18.1％)及單純Ⅰ型(16％)。絕大部分Modic改變均發(fā)生于下腰椎位置（L4/L5及L5/S1，

3、83％），其在椎間盤的上/下終板之間分布并無顯著差異，且77.9％的Modic改變在同一椎間盤的上/下方成對出現(xiàn)。
　　有關(guān)Modic改變的成因現(xiàn)存有多種理論，其中最為經(jīng)典的是力學(xué)損傷機(jī)制。椎體終板是腰椎解剖結(jié)構(gòu)的薄弱部位，因此傳統(tǒng)理論認(rèn)為椎間盤內(nèi)應(yīng)力可集中于終板，致使終板發(fā)生退變。終板的部分區(qū)域應(yīng)力集中的發(fā)生可引發(fā)終板裂隙，終板下部分區(qū)域骨質(zhì)逐漸鈣化，而Modic改變則反映了相應(yīng)的急性出血水腫（Ⅰ型）-慢性炎癥修復(fù)（Ⅱ型）-區(qū)域

4、骨化（Ⅲ型）的進(jìn)程。Modic改變的另一種病變機(jī)制可能涉及營養(yǎng)方面因素，研究顯示維生素D攝入量與Modic改變發(fā)生率之間存在正相關(guān)，其可能與維生素D對鈣離子代謝的影響相關(guān)。而吸煙及高血脂引起的血管功能障礙亦被認(rèn)為與Modic改變發(fā)生率呈正相關(guān)。此外，近年來痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)感染與Modic改變引起了廣泛的爭議及研究。P.acnes的出現(xiàn)與Modic改變的發(fā)生高度相關(guān)，而雙盲病例對照研究顯示抗生素治療對伴有Ⅰ型Modic改變的

5、腰背痛患者具有較好的治療效果。
　　本研究的興趣在于進(jìn)一步研究Modic改變的發(fā)生機(jī)制，在細(xì)胞培養(yǎng)，動物模型兩個層面分別觀察低毒性細(xì)菌感染及組織缺血對腰椎間盤及其相鄰終板結(jié)構(gòu)的影響，通過影像學(xué)，分子生物學(xué)及病理學(xué)手段進(jìn)行評估。
　　目的：
　　通過體外細(xì)胞培養(yǎng)及動物模型研究，了解骨性終板區(qū)感染、缺血等損傷對腰椎間盤及終板的影響，探究其損傷機(jī)制，進(jìn)而探索相應(yīng)病因下治療或預(yù)防椎間盤疾病的新策略。
　　方法：
　

6、　1.獲取大鼠椎間盤髓核細(xì)胞及終板細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同的刺激(P.acnes細(xì)菌上清液，缺氧生長環(huán)境或血管生長抑制劑)觀察細(xì)胞生長情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)和細(xì)胞活性檢測。
　　2.構(gòu)建經(jīng)肌間隙開放手術(shù)入路的兔腰椎間盤髓核穿刺通道，并以此通道注射痤瘡丙酸桿菌建立相應(yīng)動物模型。收集標(biāo)本進(jìn)行影像學(xué)檢查，基因表達(dá)，分子生物學(xué)測試，病理學(xué)檢測等。
　　3.構(gòu)建兔腰椎間盤終板下穿刺通道，并以此通道注射痤瘡丙酸桿菌或博來霉素（血

7、管抑制劑）建立相應(yīng)動物模型。收集標(biāo)本進(jìn)行影像學(xué)檢查，基因表達(dá)，分子生物學(xué)測試，病理學(xué)檢測等評估模型。
　　結(jié)果：
　　1.低毒性細(xì)菌感染或缺氧對椎間盤細(xì)胞的刺激作用
　　1.1、低毒性細(xì)菌感染抑制髓核及終板細(xì)胞的生長
　　細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，當(dāng)共培養(yǎng)的細(xì)菌上清液濃度大于4*106 CFU/mL時，髓核細(xì)胞發(fā)生大量死亡;當(dāng)濃度小于2.5*105 CFU/mL時，髓核細(xì)胞生長受到明顯抑制。當(dāng)共培養(yǎng)的細(xì)菌上清液濃度大于2

8、*106 CFU/mL時，終板軟骨細(xì)胞發(fā)生大量死亡;當(dāng)濃度小于5*105 CFU/mL時，終板軟骨細(xì)胞生長受到明顯抑制。
　　1.2、低毒性細(xì)菌感染刺激髓核及終板細(xì)胞炎癥反應(yīng)基因的表達(dá)
　　基因表達(dá)結(jié)果顯示一定濃度的P.acnes上清液刺激可顯著提高髓核及終板細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)基因如MMP-9、ADAMTSs等的表達(dá)，同時下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)，如蛋白聚糖、膠原蛋白等的表達(dá)水平。
　　1.3、血管生長抑制劑博來霉素對健康

9、終板細(xì)胞無顯著損傷作用
　　使用62.5μg/ml血管生長抑制劑博來霉素培養(yǎng)正常終板細(xì)胞48小時后，終板細(xì)胞存活率及活性與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異;細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)（Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等）與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.4、缺氧環(huán)境對髓核及終板細(xì)胞的刺激作用
　　細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，終板細(xì)胞在缺氧（5％二氧化碳，3％氧分壓）環(huán)境下增殖速度減慢約40％，細(xì)胞代謝水平降低，無氧代謝產(chǎn)物增加，細(xì)胞活性下降;膠原及

10、蛋白聚糖等細(xì)胞外加基質(zhì)合成減少，同時降解基質(zhì)的MMPs及ADAMTSs表達(dá)增加。髓核細(xì)胞在缺氧環(huán)境中活性未見明顯變化，僅有HIF-1α及ADAMTS-5表達(dá)上調(diào)。
　　2.腰椎間盤內(nèi)低毒性細(xì)菌感染對在體腰椎終板及髓核的影響
　　2.1、腰椎間盤內(nèi)低毒性細(xì)菌感染引發(fā)顯著的的終板區(qū)域及椎間盤MRI退變表現(xiàn)
　　通過開放手術(shù)經(jīng)側(cè)方肌間隙入路暴露椎間盤并進(jìn)行穿刺，椎間盤內(nèi)注射P.acnes后，可發(fā)現(xiàn)在術(shù)后2周時即有椎間盤信號降

11、低表現(xiàn)。至術(shù)后9月時，幾乎所有實(shí)驗椎間盤均發(fā)生不同程度退變。術(shù)后3月有部分節(jié)段終板區(qū)域發(fā)生Ⅰ型Modic改變，并在術(shù)后6月開始部分轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐蚆odic改變。
　　2.2、腰椎間盤內(nèi)低毒性細(xì)菌感染引發(fā)的椎間盤基質(zhì)降解及終板區(qū)域炎癥反應(yīng)
　　P.acnes椎間盤內(nèi)感染可顯著增加椎間盤組織中細(xì)胞外基質(zhì)（如蛋白聚糖等）的分解，同時引發(fā)的炎癥反應(yīng)破壞了終板軟骨結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步促進(jìn)了椎間盤的退變。qPCR顯示髓核內(nèi)前炎癥因子如IL-1β、T

12、NF-α、IFN-γ及基質(zhì)降解酶MMP-9、ADAMTS-5表達(dá)顯著上調(diào)，同時終板區(qū)域IL-1β、TNF-α及ADAMTS-5表達(dá)量顯著升高。提示P.acnes感染引起了較為劇烈的椎間盤及終板區(qū)域炎性反應(yīng)。
　　2.3、腰椎間盤內(nèi)低毒性細(xì)菌感染與終板下骨質(zhì)的吸收與重構(gòu)
　　P.acnes感染椎間盤內(nèi)后9月，終板骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯骨吸收樣改變，骨小梁較為稀疏，骨密度顯著降低，骨相對體積顯著降低而BS/BV顯著升高，骨小梁厚度明顯降

13、低。病理切片亦顯示在部分區(qū)域可見終板區(qū)域異位骨化增生情況。
　　3.腰椎終板區(qū)低毒性細(xì)菌感染及血管抑制對在體腰椎終板及髓核的損傷作用
　　3.1、腰椎終板區(qū)低毒性細(xì)菌感染引發(fā)的終板區(qū)域及髓核MRI影像學(xué)變化
　　通過X線透視下經(jīng)皮穿刺椎間盤終板下骨，并經(jīng)該通道注射P.acnes后，可發(fā)現(xiàn)在術(shù)后6月均無顯著椎間盤退變表現(xiàn)。在術(shù)后6月時，約1/3椎體鄰近終板區(qū)域發(fā)生T1及T2像MRI信號升高表現(xiàn)，提示發(fā)生Ⅱ型Modic改變

14、。
　　3.2、腰椎終板區(qū)低毒性細(xì)菌感染誘發(fā)炎癥損傷
　　P.acnes終板下感染時，終板下骨內(nèi)前炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等表達(dá)顯著升高，提示P.acnes感染引起的溫和而慢性的終板區(qū)域炎癥樣反應(yīng)。同一時間內(nèi)，椎間盤內(nèi)部并無顯著炎癥因子上升或炎性反應(yīng)表現(xiàn)。
　　3.3、腰椎終板區(qū)低毒性細(xì)菌感染作用下的骨結(jié)構(gòu)改變
　　病理切片及Micro-CT檢查結(jié)果顯示，相比直接感染椎間盤內(nèi)而言，終板下骨區(qū)域

15、P.acnes感染并無明顯終板骨性結(jié)構(gòu)重塑反應(yīng)，終板下骨僅可見輕度骨吸收反應(yīng)。同時，病理檢查顯示部分樣本（3例）可見終板裂隙。
　　3.4、抑制血管生成在終板區(qū)域引發(fā)的終板區(qū)域MRI影像學(xué)變化
　　通過X線透視下經(jīng)皮穿刺椎間盤終板下骨，并經(jīng)該通道注射博來霉素抑制血管生成后，可發(fā)現(xiàn)在術(shù)后6月均無顯著椎間盤退變表現(xiàn)。在術(shù)后2月、3月及6月時，約1/3椎體鄰近終板區(qū)域發(fā)生T1及T2像MRI信號降低表現(xiàn)，提示發(fā)生Ⅲ型Modic改變，

16、即終板區(qū)域骨化表現(xiàn)。
　　3.5、抑制血管生成在終板區(qū)域誘發(fā)的骨結(jié)構(gòu)改變
　　對實(shí)驗動物終板下骨Micro-CT掃描結(jié)果顯示骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，但厚度增加，BMD升高，骨相對體積增加，提示終板下骨區(qū)域發(fā)生區(qū)域部分吸收，同時在大范圍內(nèi)發(fā)生骨化反應(yīng)。終板下骨內(nèi)炎癥因子如IL-1β、TNF-α表達(dá)升高。
　　結(jié)論：
　　1.低毒性細(xì)菌上清液在髓核及軟骨終板細(xì)胞體外培養(yǎng)時可顯著抑制細(xì)胞生長，下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)水平，同時上

17、調(diào)基質(zhì)降解酶，如MMPs、ADAMTSs的表達(dá)。同時，髓核細(xì)胞在缺氧環(huán)境下增殖速度減緩，代謝水平降低，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少而降解增加。血管抑制劑博來霉素在體外培養(yǎng)時并沒有顯著細(xì)胞毒性，不會損害髓核細(xì)胞及終板細(xì)胞的活性及代謝水平。
　　2.低毒性細(xì)菌直接感染腰椎間盤可在術(shù)后3-9月引發(fā)時間依賴性的終板Modic改變及椎間盤退變，激活髓核及終板內(nèi)IL-1β、TNF-α、IFN-γ等多條炎癥通路，并促使終板下骨結(jié)構(gòu)發(fā)生骨吸收及骨重構(gòu)改變。