基于細(xì)胞阻抗分析的內(nèi)皮功能高糖損傷模型的建立及內(nèi)皮保護(hù)作用藥物的篩選.pdf

1、糖尿病血管并發(fā)癥包括糖尿病微血管并發(fā)癥和糖尿病大血管并發(fā)癥，是使糖尿病患者致死、致殘的主要原因。糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷是糖尿病大血管及微血管病變的始動環(huán)節(jié)及病理生理基礎(chǔ)，而糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷又是多種影響因素作用于不同發(fā)病環(huán)節(jié)、影響多種分子機(jī)制的結(jié)果。作為糖尿病的共同特征，高血糖是參與導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷的不同發(fā)病機(jī)制及發(fā)病環(huán)節(jié)的一個獨立的致病因素。糖尿病患者在降血糖治療的同時，預(yù)防和治療血管并發(fā)癥也同樣重要。 本研究利

2、用細(xì)胞的阻抗分析，能非標(biāo)記、實時地反映細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)；將基于細(xì)胞的阻抗分析應(yīng)用于內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的研究，建立了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和動態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷檢測方法，對高血糖參與糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷的發(fā)病機(jī)制研究和抗糖尿病血管并發(fā)癥藥物篩選評價有重要的指導(dǎo)意義。 本研究基于細(xì)胞阻抗分析的RT-CES系統(tǒng)實時地監(jiān)測了高糖(27.8mM)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的損傷過程，檢測到細(xì)胞從貼附、伸展、增殖到融合，以及損傷過程中高糖

3、引起的電極阻抗的變化過程，提示內(nèi)皮細(xì)胞在損傷過程中屏障功能變化的動態(tài)過程。同時結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性實驗和細(xì)胞骨架染色進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的實驗研究，以及高糖誘導(dǎo)單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和ATP作用下一氧化氮釋放和鈣振蕩的失調(diào)的研究。建立了一套基于細(xì)胞阻抗分析的高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和動態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷檢測方法。 應(yīng)用本研究建立的基于細(xì)胞阻抗分析的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和動態(tài)檢測方法，進(jìn)行了內(nèi)皮保護(hù)作用藥物的篩選，發(fā)現(xiàn)中藥提取物黃芪甲苷具有

4、顯著改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能損傷的作用，能明顯抑制高糖引起的電極阻抗降低。利用通透性實驗和細(xì)胞骨架染色也表明了黃芪甲苷的內(nèi)皮保護(hù)作用，結(jié)果顯示黃芪甲苷能顯著的改善高糖引起的FITC-dextran通透性增加以及細(xì)胞骨架的重分布。提示基于細(xì)胞阻抗分析的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和動態(tài)檢測方法，與傳統(tǒng)的研究方法的結(jié)果一致。 蛋白激酶C是糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在本研究建立的高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，蛋白激酶被活化，免疫酶聯(lián)

5、反應(yīng)和熒光探針標(biāo)記顯示膜上的分布和活性顯著增強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了藥物內(nèi)皮保護(hù)作用的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能顯著地抑制高糖引起的膜上蛋白激酶C的活化，蛋白印跡顯示黃芪甲苷能顯著地抑制高糖誘導(dǎo)的蛋白激酶Cα和β2的高表達(dá)，相對正常組，低、中、高三個劑量組蛋白激酶Cα的表達(dá)分別從254±17.3％降到了130±23.1％，97±9.9％和94±11％；對于蛋白激酶Cβ2，中、高劑量的黃芪甲苷顯著地降低其表達(dá)量，蛋白激酶Cβ2的表達(dá)分別從

6、270±25.1％降到了190±9.1％和125±19.3％。 研究表明，基于細(xì)胞的阻抗分析方法能動態(tài)地監(jiān)測內(nèi)皮屏障功能的損傷過程，建立的內(nèi)皮細(xì)胞損傷實時阻抗監(jiān)測模型能有效地篩選、評價抗高血糖藥物的內(nèi)皮保護(hù)作用。研究證明了黃芪甲苷具有內(nèi)皮保護(hù)作用，能顯著地改善高糖引起的內(nèi)皮功能損傷，并通過抑制蛋白激酶Cα和β2的活化而起作用，提示通過篩選蛋白激酶C選擇性抑制劑而開發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥治療藥物的可行性。本研究建立的基于阻抗分析的內(nèi)皮