復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏抗急性肝損傷作用及對(duì)炎癥干預(yù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、很多因素都可以引起肝臟損傷，包括外傷導(dǎo)致的肝損傷、化學(xué)性肝損傷(包括藥物性肝損傷和非藥物性肝損傷，主要是由于平時(shí)用藥及酒精等因素造成的肝臟損傷)以及病毒性肝炎所導(dǎo)致的肝損傷等。其中以病毒性肝炎引起的肝損傷最為常見。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，根據(jù)1992-1995年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查，人群HBsAg攜帶率達(dá)9.75％，約1.2億人。探討中藥對(duì)肝臟的保護(hù)作用以及抗炎的機(jī)制對(duì)開發(fā)新的抗肝炎藥物有重要意義。近年的研究表明：肝炎的發(fā)生

2、機(jī)制除與引起炎癥的病毒有關(guān)外，還與機(jī)體的免疫機(jī)制引起的肝臟損傷有關(guān)。炎癥的組織學(xué)特征是炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子等都在肝炎發(fā)病的病理過程中起關(guān)鍵性作用。 小花清風(fēng)藤(Sabia.parvifloraWall.exRoxb)為苗族民間藥物，是清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物，主要分布于云南、廣西、貴州等地，以前的研究資料表明，其對(duì)甲肝及乙肝的治療效果均較顯著，有很好的利濕退黃和降轉(zhuǎn)氨酶作用。但相關(guān)的藥理研究資料極少。貴州省

3、科技產(chǎn)業(yè)廳立項(xiàng)，對(duì)該藥進(jìn)行化學(xué)和活性的系統(tǒng)研究，并研制抗肝損傷的新藥。復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏主要由小花清風(fēng)藤、三七、石斛組成，有清肝利膽的功效，主要用于治療病毒性肝炎。 本研究采用四氯化碳、α-萘異硫氰酸酯、D-氨基半乳糖、卡介苗聯(lián)合脂多糖誘發(fā)四種肝損傷模型，采用生物化學(xué)、酶聯(lián)免疫分析、免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等手段，從肝臟功能、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞因子的表達(dá)、肝細(xì)胞凋亡以及轉(zhuǎn)錄因子的活化等環(huán)節(jié)探討了復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏對(duì)不同肝損

4、傷模型的保護(hù)作用及其對(duì)炎癥干預(yù)作用的相關(guān)機(jī)制。 第一部分復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)急性肝損傷動(dòng)物模型的保護(hù)作用1復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)四氯化碳(CCL4)、α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致小鼠肝損傷模型的保護(hù)作用目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)四氯化碳致急性化學(xué)性肝損傷模型及α-萘異硫氰酸酯致膽?zhàn)霭Y模型小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶及膽紅素含量的影響，探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)肝細(xì)胞膜通透性和膽汁排泄功能的影響。 方法：分別采用四氯化碳皮下注射、α-萘

5、異硫氰酸酯灌胃致小鼠急性肝臟損傷，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)四氯化碳致肝損傷模型小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量的影響；α-萘異硫氰酸酯致肝損傷模型小鼠血清中ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)及總膽紅素(T-Bil)含量的影響。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)四氯化碳、α-萘異硫氰酸酯所造成的肝臟損傷有一定的保護(hù)作用。 2復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型的保護(hù)作用目的：探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)D-氨

6、基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝細(xì)胞膜通透性、肝臟的合成功能、肝臟病理形態(tài)學(xué)改變及脂質(zhì)過氧化損傷的影響。 方法：采用D-氨基半乳糖腹腔注射致大鼠肝臟損傷，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)模型大鼠血清中ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALP、ALB、Glu、T-Bil含量的影響，以及肝臟中SOD和MDA含量的影響。并做HE染色、PAS染色及甲綠-派羅寧染色觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)模型大鼠肝組織病理形態(tài)、糖原及核酸合成的影響。 結(jié)論：復(fù)方小

7、花清風(fēng)藤能夠顯著減輕D-氨基半乳糖所引起的大鼠肝臟損傷，抗脂質(zhì)過氧化損傷，并改善肝臟的合成功能。 3復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)卡介苗聯(lián)合脂多糖致小鼠免疫性肝損傷模型的保護(hù)作用目的：探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)免疫性肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞膜通透性和肝臟病理形態(tài)學(xué)改變的影響。 方法：小鼠尾靜脈注射卡介苗，12天后尾靜脈注射微量的脂多糖，造成免疫性肝損傷，4小時(shí)后取血，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)模型小鼠血清中ALT、AST含量及肝臟病理組織形態(tài)學(xué)的影響

8、。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)卡介苗聯(lián)合脂多糖致小鼠免疫性肝損傷模型有一定的保護(hù)作用。 附：小花清風(fēng)藤的抗病毒實(shí)驗(yàn)采用一日齡北京鴨靜脈注射乙型肝炎病毒，7天后開始給鴨口服小花清風(fēng)藤不同部位提取物，并以拉米夫定為對(duì)照藥，觀察藥物對(duì)肝炎鴨血清DHBV-DNA水平的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小花清風(fēng)藤提取物1-2g/kg，一日2次，連續(xù)10日，對(duì)肝炎鴨血清DHBV-DNA水平的抑制效果顯著，P＜0.05-0.01，且無毒副反應(yīng)。

9、 第二部分復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)肝損傷炎癥干預(yù)作用的機(jī)制研究1復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠及免疫性肝損傷模型小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：采用D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型，卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，取血，分離血清，采用ELISA方法測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-18的含量。結(jié)果：復(fù)方小花清風(fēng)藤各劑量能顯著降低血清中TNF-α、IL-1

10、β、IL-8及IL-18的含量。結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可顯著抑制肝臟損傷后炎性細(xì)胞因子的高水平表達(dá)。 2復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)免疫性肝損傷模型小鼠肝組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況及肝細(xì)胞凋亡情況的影響，探討其可能的抗肝細(xì)胞凋亡作用和作用環(huán)節(jié)。 方法：用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠的免疫性肝損傷模型，4小時(shí)后取肝臟，石蠟包埋切片，進(jìn)行TUNEL染色處理，以及Fas、FasL

11、、Bcl-2、Bax的免疫組織化學(xué)染色，并作圖像分析。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)免疫性肝損傷模型小鼠肝臟的細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。 3復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、PPARα及PPARγ表達(dá)的影響，探討其對(duì)炎癥機(jī)制中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用。 方法：用D-氨基半乳糖誘導(dǎo)大鼠的肝損傷模型，24小時(shí)

12、后取右葉肝臟，石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)染色法，觀察肝組織核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、PPARα及PPARγ的表達(dá)情況。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可抑制肝臟損傷后NF-κB的異常活化，上調(diào)PPARα及PPARγ的表達(dá)。 4復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)免疫性肝損傷模型小鼠肝組織c-mycmRNA及p38MAPK表達(dá)的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對(duì)免疫性肝損傷模型小鼠肝組織p38MAPK以及c-mycmRNA表達(dá)的影響，探討其抗肝損傷和肝細(xì)胞

13、凋亡的可能作用環(huán)節(jié)。 方法：用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘發(fā)小鼠的免疫性肝損傷模型，4小時(shí)后取右葉肝臟，以免疫組織化學(xué)染色法觀察p38MAPK的表達(dá)，以RT-PCR法研究c-mycmRNA的表達(dá)。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可以抑制免疫性肝損傷模型小鼠肝臟中p38MAPK和c-mycmRNA的表達(dá)，這可能是其抗肝損傷和肝細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。 綜上所述，復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏能夠?qū)辜毙愿螕p傷過程中轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素的升高，增強(qiáng)肝臟對(duì)

14、糖原和蛋白質(zhì)的合成，減輕脂質(zhì)過氧化損傷、有一定的保肝作用。其主要的作用機(jī)理可能和抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、NF-κB的異常活化，抑制p38MAPK和c-mycmRNA的表達(dá)，上調(diào)PPARα及PPARγ的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡等有關(guān)。 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)： 1.苗藥小花清風(fēng)藤在民間多用于治療肝炎，療效確切，但是報(bào)道小花清風(fēng)藤藥理作用的相關(guān)文獻(xiàn)極少，只有部分文獻(xiàn)介紹了對(duì)其化學(xué)成分的研究。關(guān)于小花清風(fēng)藤保肝作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及藥理研究，尚

15、未見報(bào)道。本課題對(duì)復(fù)方小花清風(fēng)藤抗急性肝損傷的作用效果及其對(duì)炎癥的干預(yù)作用進(jìn)行了探討。 2.D-氨基半乳糖致肝損傷模型是一個(gè)常用模型，本課題對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型中PPAR(過氧化物酶體增殖物激活受體)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)及藥物干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。 3.本課題對(duì)BCG/LPS致免疫性肝損傷模型中c-mycmRNA表達(dá)、p38MAPK表達(dá)及藥物干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究國內(nèi)尚未見報(bào)道，國外報(bào)道也極少