鐵超載肝損傷機(jī)理及黃芩苷干預(yù)作用的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，膳食中肉類比重的增加，體內(nèi)鐵超載（Iron overload）的現(xiàn)象值得引起重視。鐵超載是指由于遺傳因素或病理?xiàng)l件導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列病理變化。近幾年來(lái)，鐵超載所帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)，已經(jīng)引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。鐵除了可以通過(guò)催化產(chǎn)生自由基而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化以及蛋白質(zhì)氧化外，它還可能促進(jìn)活性氮的生成甚至直接催化活性氮與蛋白質(zhì)反應(yīng)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝化，同時(shí)它還會(huì)對(duì)體內(nèi)其它一些微量元素產(chǎn)生影響。鐵超載病理?xiàng)l件下，肝中蛋白質(zhì)硝化情況及

2、對(duì)其它微量元素的影響，尚未有人研究過(guò)。本文在整體動(dòng)物、細(xì)胞水平和生化水平上，分別從鐵超載對(duì)微量元素的影響及促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化和硝化兩個(gè)方面來(lái)研究鐵超載肝損傷病理機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探討了黃芩苷對(duì)鐵超載肝損傷的干預(yù)作用。主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　 1、選用成年雄性大鼠，采用兩周內(nèi)5 次腹腔注射鐵右旋糖苷（每次鐵量分別為30，60，100 mg Fe/kg bw）的方法造成大鼠慢性鐵超載模型；與此同時(shí)，對(duì)總鐵劑量為500 mg Fe

3、/kg的大鼠分別喂以含0.3%和1%黃芩苷的飼料。通過(guò)紫外可見分光光度法測(cè)定一些基本生化指標(biāo)、毛細(xì)管電泳檢測(cè)尿液中硝酸鹽含量、免疫沉淀及免疫組化分析肝中蛋白質(zhì)硝化等，來(lái)研究鐵超載導(dǎo)致肝損傷的情況及黃芩苷的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，鐵超載可以導(dǎo)致血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肝中鐵含量、丙二醛（MDA）含量、尿液中硝酸鹽含量及肝中3-硝基酪氨酸含量顯著增加，而肝中總鐵結(jié)合力及巰基（SH）含量則隨給鐵劑量的增

4、加而明顯降低；補(bǔ)充黃芩苷后能顯著降低由鐵超載所導(dǎo)致大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、ALT、AST、肝中鐵含量、MDA含量、尿液中硝酸鹽含量以及蛋白質(zhì)硝化水平的增加。這表明鐵超載除引起肝臟常規(guī)指標(biāo)改變外，同時(shí)還可引起蛋白質(zhì)發(fā)生硝化；黃芩苷的攝入能顯著減輕鐵超載所導(dǎo)致的肝臟損傷。
　　 2、選用成年雄性小鼠，采用兩周內(nèi)5 次腹腔注射鐵右旋糖苷（每次鐵量為100 mgFe/kg bw）的方法造成小鼠慢性鐵超載模型；同時(shí)喂以含1%黃芩苷的飼料。

5、利用HPLC-ICP-MS對(duì)肝線粒體、微粒體及上清液三種亞細(xì)胞器中微量元素（鐵、銅、鋅及鎘）的含量及分布進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，鐵在肝中主要以高分子量蛋白形式存在，而銅、鋅及鎘在各種分子量蛋白中均含有。鐵超載可導(dǎo)致肝中微量元素鋅及鎘的含量顯著增加，同時(shí)對(duì)銅和鎘在肝中的分布產(chǎn)生影響；黃芩苷的攝入顯著降低由鐵超載所導(dǎo)致的鐵、鋅及鎘的含量增加。這表明，過(guò)多鐵在體內(nèi)聚積將對(duì)其它微量元素的代謝產(chǎn)生影響；黃芩苷的攝入能顯著降低由鐵超載所導(dǎo)致的肝中微量元

6、素的增加。
　　 3、選用肝中重要的酶之一—谷氨酸脫氫酶（GDH）做為研究對(duì)象，采用蛋白質(zhì)硝化的兩種主要途徑（ONOO-及鐵原卟啉(hemin)-H2O2-NO2-）來(lái)引起蛋白質(zhì)氧化和硝化，通過(guò)紫外可見光譜、圓二色譜、凝膠電泳、免疫印跡以及液質(zhì)聯(lián)用等方法來(lái)研究蛋白質(zhì)氧化和硝化各自對(duì)GDH活性的影響。研究結(jié)果表明：(1)在生理pH條件下，Hemin-H2O2-NO2-和SIN-1 均可催化GDH發(fā)生蛋白氧化和硝化而使其滅活，但是蛋

7、白質(zhì)氧化（非巰基氧化）對(duì)活性的作用要顯著強(qiáng)于蛋白質(zhì)硝化；(2)Hemin-H2O2-NO2-和SIN-1 雖然都可以導(dǎo)致GDH發(fā)生蛋白質(zhì)氧化和硝化，但兩者的作用方式卻是不盡相同的。Hemin-H2O2-NO2-催化GDH發(fā)生硝化的酪氨酸殘基是Tyr262和Tyr471，而SIN-1 催化GDH發(fā)生硝化的酪氨酸殘基則是Tyr401和Tyr493。
　　 4、采用外源性硝化體系（Hemin-H2O2-NO2-及檸檬酸鐵-H2O2-N

8、O2-）來(lái)造成HepG2細(xì)胞中氧化（硝化）應(yīng)激增加，利用免疫沉淀法從其中提取谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs），然后檢測(cè)其表達(dá)水平、蛋白氧化水平、硝化水平及酶活力情況，以此來(lái)探討鐵卟啉和檸檬酸鐵在催化H2O2-NO2-所導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化和硝化上的差異，并在此基礎(chǔ)上探討黃芩苷的干預(yù)作用。研究結(jié)果表明：(1)鐵卟啉和檸檬酸鐵在催化H2O2-NO2-體系導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化和硝化的能力上有所差異。Hemin 具有較強(qiáng)的催化蛋白質(zhì)氧化和硝化的作用；而檸檬酸鐵