阻斷VWF-膠原和VWF-血小板相互作用的新型的VWF A3區(qū)單抗的研制及其功能研究.pdf

1、血栓性疾病正嚴重威脅著人類的健康，而血栓形成機理和防治的研究是醫(yī)學科學領域重大課題之一。在血栓形成過程中血小板發(fā)揮著至關重要的作用，而vonWillebrand因子（VWF）在血栓（尤且是動脈血栓）形成過程中發(fā)揮著關鍵的作用。VWF是由血小板、內(nèi)皮細胞合成的大分子量的具有粘附功能的糖蛋白，在血栓形成過程中發(fā)揮著重要作用，它既可與血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa結合，又可以和膠原結合介導血小板粘附聚集于受損的血管內(nèi)皮下組

2、織，導致血栓形成。在此過程中膠原—VWF—GPⅠb間的相互作用是血小板活化的早期事件，VWF是血小板與血管壁膠原之間的橋梁分子，因此阻斷VWF在此過程中的作用，可以有效地抑制血栓形成。 本文根據(jù)膠原—VWF—GPⅠb軸相互作用的關系，針對GPⅠbα、VWF和膠原分子進行三部分研究。（1）首先，將與VWF A1區(qū)結合的重組GPⅠbα活性片段H1—V289（rGPⅠb H1—V289）和與膠原結合的VWF—A3區(qū)基因片段分別在CHO

3、細胞和大腸桿菌細胞中表達及其生物學活性研究；（2）然后，用rVWF A3為抗原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)標準單克隆抗體技術制備和鑒定了兩株VWF A3區(qū)單抗SZ—123和SZ—125；（3）最后，對SZ—123和S2—125抑制VWF—膠原和VWF—GPⅠbα相互作用和抑制血小板在Ⅲ型膠原上粘附功能作進一步研究。試圖進一步闡明VWFA1和A3區(qū)相互作用關系和VWF構象和功能調(diào)節(jié)關系提供理論依據(jù)，同時期望獲得性能優(yōu)越的抗栓制劑，對預防和治療

4、血栓性疾病具有重要的意義。 一、重組糖蛋白Ibα活性片段H1—V289和VWF A3區(qū)的表達和功能研究 血小板上GPⅠbα是血栓形成過程中的的一個重要糖蛋白，在初期止血階段發(fā)揮著重要作用。GPIbα氨基末端分子量45KD片段（H1—V289）既是VWF A1區(qū)結合部位，又是凝血酶結合部位。因此建立表達重組糖蛋白Ibα活性片段（rGPⅠbαH1—V289）細胞株，對于研究GPⅠb—VWF—Collagen軸心中各成分之間相

5、互作用的機理和抗栓藥物的研究具有重大的理論和應用價值。我們利用脂質體將含有編碼GPⅠbα H1—V289 DNA質粒pCMV3轉染CHO細胞，用SZ—2—溴化氰活化的—Sepharose4B親和層析法純化重組片段，用SDS—PAGE和Western—blot鑒定純化產(chǎn)品的純度和免疫學活性。用血小板聚集法檢測純化產(chǎn)品對瑞斯托霉素誘導血小板聚集功能的影響。用ELISA測定純化產(chǎn)品對VWF與血小板結合能力的影響。結果是每1L培養(yǎng)上清液可純化到

6、6.15mg rGPIbα H1—V289重組產(chǎn)品。SDS—PAGE顯示，純化的重組片段主要在42KD處顯一蛋白區(qū)帶，Western—blot顯示，抗GPⅠbα單抗SZ—2能與重組片段在42KD處顯單一蛋白區(qū)帶。純化重組片段能抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集功能。ELISA測定顯示純化產(chǎn)品抑制血漿VWF與血小板的結合能力。因此我們獲得的CHO細胞株能恒定表達rGPⅠbα H1—V289，重組片段具有較高的純度、免疫學活性和生物學活性，有可

7、能開發(fā)為有效的抗血栓藥物和進行科學研究。 VWF—A3區(qū)是膠原的主要結合部位。我們應用RT—PCR方法從人臍靜脈內(nèi)皮細胞中克隆VWF—A3區(qū)基因片段。測序證明克隆的基因序列完全正確，然后構建了表達載體pET—20b—VWF—A3，在大腸桿菌中進行誘導表達，所表達的目的蛋白為菌體總蛋白的46.7%。經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖（Ni—NTA agarose）柱純化后，目的蛋白的純度在95%以上。大腸桿菌中高效表達的重組VWF—A3蛋白

8、（rVWF—A3）復性后，應用膠原結合試驗分析rVWF—A3蛋白的生物學活性。rVWF—A3與人胎盤和牛皮膚Ⅲ型膠原均有結合活性。結果表明rVWF—A3具有較高的純度和良好的生物學功能，可作為免疫原免疫Balb/C小鼠，制備抗VWF A3區(qū)的單抗。 二、VWF A3區(qū)特異性單抗SZ—123和SZ—125研制和鑒定 自從抗GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體7E3獲得FDA批準應用于缺血性心臟患者的臨床治療、PTCA術后再梗塞的預防，

9、取得了滿意的療效，抗血栓抗體藥物的研制已成為該領域的研究熱點。但在GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑的治療中，已報道若干副作用，包括出血、血小板減少等。因為VWF在血小板和膠原之間起到橋梁作用，而VWF A3區(qū)與膠原的結合是啟動血小板粘附、聚集并進而導致血栓形成的首要環(huán)節(jié)，因此針對VWF與膠原結合區(qū)域A3區(qū)的抗體有可能具有抑制血小板的粘附、聚集和抗血栓形成的作用。本研究用大腸桿菌表達的rVWF—A3蛋白免疫Balb/C小鼠，經(jīng)標準單克隆抗體技術制

10、備單抗。用ELISA法鑒定單抗特異性，經(jīng)VWF膠原結合抑制試驗篩選獲得抑制性單抗，用免疫印跡技術確定單抗與rVWF—A3和還原性人VWF識別的抗原分子。經(jīng)膠原結合試驗確定單抗對VWF與膠原結合的影響。結果共獲得一組共30株抗VWF—A3區(qū)單抗，其中兩株確定為抑制VWF與膠原結合的單抗，分別命名為SZ—123和SZ—125，兩株單抗分別與rVWF—A3和VWF反應強烈，而不與重組VWF—A1區(qū)、A2區(qū)反應。Western—blot顯示SZ

11、—123和SZ—125分別識別分子量為27kDa的rVWF—A3區(qū)帶和還原性人VWF的250KDa的VWF單體和170KDa的VWF酶切片段。因此SZ—123和SZ—125是抗VWF—A3區(qū)特異性單抗。 三、VWF A3區(qū)單抗SZ—123和SZ—125的功能研究 為了研究單抗SZ—123和SZ125生物學功能，我們首先探討兩株VWF—A3區(qū)單抗，SZ—123和SZ—125對VWF—膠原相互作用的影響。通過用膠原結合試驗測

12、定兩株單抗對VWF與人胎盤或牛皮膚Ⅲ型膠原結合反應影響，同時測定了兩株單抗對正常人、彌猴、Beagle犬、兔、大鼠和豚鼠的血漿VWF與Ⅲ型膠原結合反應的影響。結果顯示單抗SZ—123和SZ—125劑量依賴性地抑制純化的人VWF與人的Ⅲ型膠原結合（IC50=0.07±0.02和0.15±0.03μg/ml）和與牛皮膚Ⅲ型膠原結合（IC50=0.48±0.06和0.51±0.07μg/ml）。單抗SZ—123和SZ—125也抑制正常人、彌猴

13、、Beagle犬血漿與Ⅲ型膠原結合反應，但不抑制兔、大鼠和豚鼠的血漿VWF與Ⅲ型膠原結合反應。因此單抗SZ—123和SZ—125是兩株中和性抗VWF—A3區(qū)單抗，能抑制VWF—膠原相互作用，是VWF依賴的血小板黏附于膠原的有潛能的抑制劑，可成為具有治療潛力的抗血栓藥物。 然后，我們探討SZ—123和SZ—125對VWF—GPⅠbα相互作用的影響。應用瑞斯托霉素、博托酶素、牛血漿、膠原和ADP為誘導劑進行血小板聚集試驗。用ELIS

14、A測定了SZ—123和SZ—125對VWF與固相化的重組血小板GPIbα（H1—V298）活性片段或血小板結合的影響。血小板聚集試驗顯示SZ—123和SZ—125分別抑制瑞斯托霉素、博托酶素、牛血漿誘導的血小板聚集，而不抑制膠原或ADP誘導的人血小板聚集。SZ—123和SZ—125也抑制瑞斯托霉素誘導的VWF與固相化的重組血小板GPⅠbα活性片段（rGPⅠbα H1—V298）或血小板的結合。因此，單抗SZ—123和SZ—125不僅抑制

15、VWF—膠原的相互作用，而且阻斷VWF—血小板相互作用。另外，這兩株單抗也可以幫助我們說明VWFA1和A3區(qū)之間的相互作用。我們認為單抗SZ—123和SZ—125結合到VWF A3環(huán)，調(diào)節(jié)A1區(qū)的構型和功能。 最后，我們探討了SZ—123和SZ—125在高剪切力下對VWF依賴的血小板在膠原上的黏附作用影響。通過應用剪切力為1000S—1的Flow chamber試驗，經(jīng)肝素抗凝的人全血在已包被人胎盤或牛皮膚Ⅲ型膠原的小室中灌注，

16、然后在顯微鏡下觀察單抗SZ—123和SZ—125對血小板在膠原表面上粘附的影響。同時，在上述相同剪切力下觀察單抗SZ—123和SZ—125對血小板在固相化VWF表面上粘附的影響。Flow chamber試驗顯示SZ—123和SZ—125分別抑制高剪切力下人血小板在人胎盤或牛皮膚Ⅲ型膠原上的粘附。SZ—123和SZ—125抑制人血小板粘附到人胎盤膠原上的IC50值分別是3.6±0.5μg/ml和10.3±4.8μg/ml，而粘附到牛皮膚膠

17、原上的IC50值分別是3.1±0.6μg/ml和11.3±3.6μg/ml。有趣的是SZ—123和SZ—125不抑制高剪切力下人血小板在固相化VWF表面上的粘附。至于SZ—123和SZ—125如何調(diào)節(jié)VWF A1區(qū)功能，VWF A1和A3區(qū)的構型和功能之間的關系我們需要作進一步的研究和探討。 總之，我們研制和鑒定了兩株新型的VWF A3區(qū)特異性單抗SZ—123和SZ—125。SZ—123和SZ—125不僅抑制在靜止和流動條件下V