緩激肽抑制TNF-α-ACTD誘導(dǎo)HLB-,2-G-,5-心肌細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikrein/kinin system，KKS）是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)心腦血管及腎臟有明顯的保護(hù)作用。KKS包括激肽釋放酶（kallikrein）、激肽原(kininogen)、激肽(kinin)、激肽BK1、BK2受體(bradykinin B1 receptor，bradykinin B2 receptor)和激肽酶(kininase)等幾種成分。激肽釋放酶是一種絲氨酸蛋白酶，可將低分子量的

2、激肽原分解釋放出有血管活性的激肽。現(xiàn)已公認(rèn)，緩激肽（bradykinin，BK）是生理?xiàng)l件下主要的激肽類(lèi)物質(zhì)，它通過(guò)與B2受體結(jié)合，激活了NO-cGMP，前列環(huán)素-cAMP等信號(hào)通路，發(fā)揮各種生物學(xué)效應(yīng)，包括血管舒張，平滑肌的收縮與舒張，炎癥和疼痛等。HOE140是B2受體特異性的拮抗劑，可阻斷緩激肽的上述效應(yīng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，KKS對(duì)于缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用，并可逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)和腎臟的纖維化。而對(duì)于TNF-a導(dǎo)致的心

3、肌細(xì)胞凋亡，KKS是否也有類(lèi)似的保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以HLB2G5心肌細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡，探討了緩激肽對(duì)TNF-a誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響，并初步研究了其中可能的信號(hào)機(jī)制。
　　 方法：在細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入緩激肽（100nmol/L），HOE140（1μmol/L）2h后，TNF-a（20ng/ml）與ACTD（200ng/ml）共同誘導(dǎo)HLB2G5心肌細(xì)胞凋亡。MTT法檢測(cè)TNF-a的

4、致凋亡效應(yīng)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)（APOPercentageTM Apoptosis Assay Kit及丫啶橙/溴化乙啶染色）和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)觀察緩激肽對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。Western Blot方法檢測(cè)PI3K，p-AKT，Bcl-xL及Bax蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：TNF-a可聯(lián)合ACTD誘導(dǎo)HLB2G5心肌細(xì)胞的凋亡，其效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。APOPercentageTM Apoptosis Assay 及丫啶橙/

5、溴化乙啶染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)均證明了緩激肽的抗凋亡效應(yīng)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，加入緩激肽干預(yù)后，細(xì)胞凋亡數(shù)為（6.7±3）%，明顯少于溶媒組（10.4±4.3）％；而加入HOE140后，凋亡率又明顯上升，為（8.9±1.0）％。BK組與溶媒組的PI3K，p-AKT，Bax在蛋白質(zhì)水平無(wú)明顯差異，對(duì)于Bcl-xL，BK組比溶媒組表達(dá)明顯升高。
　　 結(jié)論：緩激肽通過(guò)與B2受體結(jié)合，抑制TNF-a/ACTD誘導(dǎo)的HLB2G5心肌細(xì)胞凋亡