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文檔簡介
1、第一部分,目的:越來越多證據(jù)顯示急性心肌梗死中過量腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)表達(dá)對心肌細(xì)胞不利。心肌缺血時,TNF-α主要來源于巨噬細(xì)胞。隨著缺血狀態(tài)的持續(xù),心肌細(xì)胞開始分泌TNF-α。我們探討缺氧是否通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子TNF-α。
方法:和結(jié)果:分離新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,
2、分別給予氧濃度1%缺氧刺激5分鐘,15分鐘,30分鐘,1小時,2小時,4小時,6小時,12小時,24小時。Westernblot 檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平;免疫熒光檢測HIF-1α蛋白表達(dá)以及入核情況;實時定量RT-PCR 檢測TNF-αmRNA表達(dá)水平;ELISA 檢測TNF-α蛋白表達(dá)分泌。結(jié)果顯示TNF-αmRNA 從1小時開始表達(dá)上調(diào),與空白組相比增加至1.99±0.27倍(p<0.01),12小時及24小時達(dá)峰值,分別
3、為4.06±0.84倍和4.09±0.81倍(p<0.01)。TNF-α蛋白分泌表達(dá)在6小時可檢測到,12小時達(dá)峰值為48.12±11.52pg/ml(p<0.01)。缺氧對HIF-1αmRNA水平無影響,HIF-1α蛋白缺氧30分鐘表達(dá)明顯,1小時達(dá)峰值。免疫熒光染色提示缺氧15分鐘HIF-1α蛋白開始表達(dá)且向核內(nèi)聚積。核轉(zhuǎn)染法進(jìn)行心肌細(xì)胞HIF-1αRNA 干擾,發(fā)現(xiàn)siRNA顯著抑制HIF-1αmRNA水平的同時,抑制缺氧12小時
4、后TNF-αmRNA水平上調(diào)(3.75±0.45 foldvs1.38±0.76 fold, p<0.01)。HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)能有效抑制缺氧刺激后HIF-1α蛋白表達(dá),也能抑制缺氧12小時后TNF-αmRNA水平上調(diào)(2.82±0.41foldvs1.31±0.37 fold,p<0.01)以及蛋白分泌(48.12±11.52pg/mlvs23.22±2.62, p<0.
5、05)。
結(jié)論:缺氧能誘導(dǎo)離體心肌細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α,HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌TNF-α過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
第二部分,目的:探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)對于腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是否有直接啟動作用。
方法:和結(jié)果:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞
6、,給予氧濃度1%缺氧刺激及氯化鈷模擬缺氧刺激后,western blot 檢測胞核HIF-1α蛋白表達(dá)水平,實時定量RT-PCR 檢測TNF-αmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示缺氧6小時及氯化鈷刺激3小時可明顯觀察到HIF-1α蛋白在胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),缺氧12h及氯化鈷刺激12h后與空白組相比TNF-αmRNA水平明顯上升。HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)能有效抑制氯化鈷模擬缺氧刺激后HIF-1
7、α在核內(nèi)聚積,也能抑制氯化鈷模擬缺氧刺激后TNF-αmRNA水平上調(diào)。分析TNF-α轉(zhuǎn)錄起始位點上游5000bp的啟動子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)七個可能缺氧反應(yīng)元件(hypoxiaresponse elements,HREs)。5’端續(xù)減法構(gòu)建8個不同長度的報告基因質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,予氧濃度1%缺氧刺激24小時后雙熒光素酶報告基因法檢測啟動子活性。結(jié)果顯示TNF-α轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1470bp 處可能為缺氧誘導(dǎo)TNF
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