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文檔簡介
1、目的:以雙鏈重組 AAV9(dsAAV9)型腺相關(guān)病毒為載體介導(dǎo)的FrzA基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,觀察是否能抑制心肌細(xì)胞 Wnt通路表達(dá)活性,從而減輕心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活。
方法:利用 TNF-α刺激 H9c2心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,模擬體內(nèi)心肌缺血狀態(tài), MTT法檢測細(xì)胞活性及 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡率,確定 TNF-α最佳濃度。dsAAV9介導(dǎo) FrzA基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞
2、, Western blot檢測各組細(xì)胞 Wnt通路關(guān)鍵分子蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測各組細(xì)胞 Wnt通路關(guān)鍵分子 mRNA的表達(dá)。Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá), AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率的變化。
結(jié)果:
(1)免疫熒光結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的純度可達(dá)到98%以上。
(2) MTT與 AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示 TNF-α濃度對心
3、肌細(xì)胞活性的影響是以劑量依賴的方式,隨著 TNF-α的濃度增加,心肌細(xì)胞活性降低,細(xì)胞凋亡率增高,應(yīng)選擇濃度50μg/L的TNF-α來建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型。
?。?) Western blot及 RT-PCR結(jié)果均顯示 TNF-α可有效激活 Wnt信號通路,且 FrzA基因轉(zhuǎn)染可抑制 Wnt信號通路的活性。
?。?) Western blot及 AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示,TNF-α激活 Wnt信
4、號通路后,細(xì)胞凋亡增多。而 dsAAV9介導(dǎo) FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕 TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,并且這種抗凋亡作用有可能正是通過抑制 Wnt信號通路來實(shí)現(xiàn)的。
結(jié)論:CMV啟動子介導(dǎo)的dsAAV9載體可高效的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,TNF-α刺激體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,模擬體內(nèi)心力衰竭狀態(tài),激活 Wnt信號通路,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。DsAAV9介導(dǎo) FrzA基因轉(zhuǎn)染可抑制心肌細(xì)胞 Wnt信號通路的表達(dá)活性,可
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