黃芪調(diào)控內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制減輕缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷的研究.pdf

1、我們以往的研究表明，嚴(yán)重?zé)齻笤缙?在因毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致有效循環(huán)血容量顯著減少之前)即出現(xiàn)的心肌損害及心臟泵血功能減弱，不僅引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，成為燒傷早期缺血缺氧的重要啟動(dòng)因素之一。根據(jù)這一認(rèn)識(shí)，提出了燒傷早期缺血缺氧損害的“休克心”假說(shuō)。因此，防治燒傷后“休克心”對(duì)減輕嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯎p害具有重要臨床意義，但目前尚缺乏有效措施。缺血缺氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)蓄積所致的氧化損傷是心肌損傷的重要原因。清除

2、ROS可以有效減輕心肌細(xì)胞損傷，是防治缺血缺氧心肌損害的一個(gè)重要方向。 黃芪的主要化學(xué)成分有皂甙、黃酮、多糖、微量元素，以及氨基酸、亞油酸等。它對(duì)缺血缺氧心肌具有保護(hù)作用，作用機(jī)制不甚清楚，限制了對(duì)它的深入研究和推廣應(yīng)用。黃芪甲苷是一種從黃芪中提取的皂甙類(lèi)化合物，《中國(guó)藥典》中以其作為判斷黃芪及其制品，如黃芪口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。槲皮素是黃芪黃酮類(lèi)化合物中含量較高的一種。這兩種單體清除ROS，減輕其他疾病導(dǎo)致的心肌氧化損傷的作用均已

3、見(jiàn)報(bào)道，但對(duì)燒傷早期缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以及是否通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制減輕缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷，還缺乏研究。 一、研究目的： 本研究選取這兩種具有代表性的黃芪單體，旨在觀察比較它們對(duì)缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷的作用并確定其量效關(guān)系；選擇效果較好的一種單體和劑量，深入探討其除ROS的機(jī)制，明確黃芪甲苷是否通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性抗氧化機(jī)制減輕缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷，為臨床防治燒傷后“休克心”提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、

4、材料方法： 1．分離培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，在94％N2、5％CO<,2>、1％O<,2>的混合氣體中培養(yǎng)，制作缺氧模型，缺氧時(shí)間為12h。 2．將細(xì)胞隨機(jī)分為常氧組(A組)、單純?nèi)毖踅M(B組)、缺氧+槲皮素組(C組，C<,1>組100 mg/L、C<,2>組50 mg/L、C<,3>組25 mg/L)、缺氧+黃芪甲苷組(D組，D<,1>組．50mg/L、D<,2>組25 mg/L、D<,3>組12.5 mg/L)，缺氧+

5、維生素E組(E組10 mg/L)。槲皮素、黃芪甲苷濃度根據(jù)已有文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。 3．每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，檢測(cè)常氧、缺氧和缺氧條件下黃芪單體作用前后各組心肌細(xì)胞活力(CCK-8)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)的含量；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，槲皮素、黃芪甲苷組分別選擇一種劑量，檢測(cè)其作用前后缺氧細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的變化。 4．根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選黃芪甲苷(25mg/L)進(jìn)一步研究

6、其清除ROS的機(jī)制。 5．利用化合反應(yīng)使FITC或HRP與黃芪甲苷分子連接，以達(dá)到標(biāo)記和示蹤黃芪甲苷分子的目的。在熒光倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或透射電子顯微鏡下觀察標(biāo)記后的黃芪甲苷分子入胞和胞內(nèi)分布情況。 6．試劑盒檢測(cè)黃芪甲苷在體外自由基生成體系中清除羥自由基(OH<'->)、超氧陰離子(O<,2><'->)的能力。 7．用SOD阻斷劑DDC阻斷內(nèi)源性SOD活性后，檢測(cè)黃芪甲苷清除缺氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的能力

7、的變化情況。 8．采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)常氧和缺氧(缺氧時(shí)間為12h或3h)情況下黃芪甲苷作用前后心肌細(xì)胞SOD-1 mRNA表達(dá)量的變化。 9．采用免疫蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)常氧和缺氧(缺氧時(shí)間為12h)情況下黃芪甲苷作用前后心肌細(xì)胞SOD-1蛋白表達(dá)量的變化。 10．所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析On

8、e-Way ANOVA或均值t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為非常顯著。 三、主要結(jié)果： 1．單純?nèi)毖踅M培養(yǎng)液中LDH、MDA濃度和細(xì)胞中的ROS濃度較常氧組明顯升高，細(xì)胞活力、SOD活性下降。缺氧+槲皮素(25～100 mg/L)組、缺氧+黃芪甲苷(12.5～50mg/L)組、缺氧+維生素E(10mg/L)組培養(yǎng)液中LDH、MDA濃度和細(xì)胞中ROS濃度較單純?nèi)毖踅M下降，細(xì)胞活力、SOD活性回升。黃芪甲苷、槲

9、皮素的中劑量和大劑量組(C<,1-2>、D<,1-2>)改善各個(gè)指標(biāo)的作用均優(yōu)于黃芪甲苷、槲皮素低劑量組(C<,3>、D<,3>)和維生素E(10mg/L)組。同等劑量(C<,1>與D<,1>，C<,2>與D<,2>)相比，黃芪甲苷組降低LDH濃度和提高細(xì)胞活力的作用優(yōu)于槲皮素組，但二者降低MDA、ROS濃度、提高SOD活性的作用無(wú)顯著差異。 2．合成并提純了黃芪甲苷-BSA-FITC和黃芪甲苷-BSA-HRP化合物。分別在49

10、5nm(FITC在此處有特征吸收率)、403nm(HRP在此處有特征吸收率)處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定化合物中FITC、HRP濃度，結(jié)果如下：FITC：7.2mg/L，HRP：44mg/L。 3．熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察黃芪甲苷-BSA-FITC胞內(nèi)分布情況，可見(jiàn)心肌細(xì)胞胞漿中有彌散的綠色熒光，分布不均，胞核中無(wú)熒光分布；透射電鏡下觀察黃芪甲苷-BSA-HRP分布情況，可見(jiàn)高電子密度的黑褐色粗大顆粒分布于線粒體膜

11、上，其余細(xì)胞器和陰性對(duì)照細(xì)胞未見(jiàn)高電子密度顆粒分布。 4．體外自由基生成體系中，黃芪甲苷在12.5-100 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)OH<'->具有顯著清除能力，且隨劑量升高清除能力增強(qiáng)；黃芪甲苷對(duì)O<,2><'->無(wú)顯著清除能力。 5．黃芪甲苷(25mg/L)能顯著降低缺氧后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS濃度；SOD阻斷劑DDC(50uM)作用后，黃芪甲苷清除ROS的效應(yīng)基本消失。 6．常氧和缺氧(缺氧時(shí)間為12h或3h)條件下

12、黃芪甲苷處理后心肌細(xì)胞SOD-1mRNA表達(dá)量較前均有所增高。缺氧12h和缺氧3h變化趨勢(shì)一致。 7．常氧和缺氧(缺氧時(shí)間為12h)條件下黃芪甲苷處理后心肌細(xì)胞SOD-1蛋白量表達(dá)較前均有增高。 四、討論與結(jié)論： 1．槲皮素(25～100 mg/L)、黃芪甲苷(12.5～50 mg/L)能有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS、提高SOD活性、減輕細(xì)胞氧化損傷、提高細(xì)胞活力。其中大、中劑量的槲皮素(50、100mg/L)和黃芪甲苷

13、(25、50mg/L)對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于小劑量的槲皮素(25mg/L)、黃芪甲苷(12.5mg/L)和維生素E(10mg/L)。 2．同等劑量下，黃芪甲苷(25、50mg/L)減輕細(xì)胞損傷、保護(hù)細(xì)胞活力的作用較槲皮素(50、100mg/L)更好，但二者在減輕細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、提高SOD活力和清除ROS的作用上無(wú)顯著差異。 3．FITC標(biāo)記的黃芪甲苷分子主要分布在胞漿中；HRP標(biāo)記的黃芪甲苷分子特異性地分布在線

14、粒體膜上，在細(xì)胞膜和其他細(xì)胞器中未見(jiàn)分布。 4．在常氧和缺氧條件下，黃芪甲苷均能增加心肌細(xì)胞SOD-1 mRNA和蛋白表達(dá)量，從而加快胞內(nèi)O<,2><'->歧化為H<,2>O<,2>和OH<'->的過(guò)程。進(jìn)入細(xì)胞的黃芪甲苷又可以與OH<'->發(fā)生反應(yīng)清除部分OH<'->，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積，減輕細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等的氧化損傷，使SOD等細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶活性得以穩(wěn)定和提高，細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)作用加強(qiáng)。 5．黃芪甲苷不能