缺氧早期心肌細胞微管損傷與線粒體損害的關系研究.pdf

1、缺氧是嚴重燒傷、創(chuàng)傷及其他多種疾病最常見的病理現象之一，缺氧導致的能量代謝障礙是引起細胞和組織器官損害的根本原因。然而，長期以來人們對缺氧條件下線粒體損害及能量代謝障礙的確切機制并不完全清楚，臨床上亦缺乏有效的調理措施。近年來研究表明，微管與線粒體之間存在密切的聯(lián)系，微管除了對線粒體胞內定位及分布起一定作用外，更重要的是微管還可能了參與了線粒體呼吸功能的調節(jié)過程。這一觀點的證實將有助于為揭示缺氧細胞能量代謝障礙的發(fā)生機制與調控環(huán)節(jié)提供新

2、的切入點，為防治缺氧損害提供新的理論依據與思路，具有重要的理論意義與臨床指導價值。為證實這一推測，我們觀察了缺氧早期不同時相點的微管及線粒體變化情況，并利用特異性微管解聚劑研究了微管損傷情況下線粒體相關變化。 一、材料與方法 1．原代培養(yǎng)wistar大鼠乳鼠心肌細胞，制備缺氧模型。 2．在缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，利用掃描電鏡觀察微管的形態(tài)結構；采用激光共聚焦顯微鏡觀察微管的分布，并計算

3、微管的熒光強度；應用Western—Blot檢測微管蛋白α亞基的表達量改變，研究缺氧早期心肌細胞微管損害的時效對應性。 3．在缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，利用透射電鏡觀察線粒體的形態(tài)結構；采用激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的分布，并計算線粒體的熒光強度；應用生物耗氧呼吸儀檢測心肌細胞的呼吸控制率；應用高效液相色譜儀檢測心肌細胞ATP含量，研究缺氧早期心肌細胞線粒體損害情況。 4．以秋水仙素解聚微管，建

4、立微管解聚模型。 5．在解聚微管并缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，觀測缺氧心肌細胞線粒體的形態(tài)、分布、呼吸控制率和ATP含量，與缺氧組進行比較，分析微管損害在線粒體損害中的作用。 6．統(tǒng)計學處理所有數據以均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗。以P<0.05和P<0.01分別表示相差顯著和非常顯著。 二、主要結果 1．缺氧后10min，心肌細胞微管的念珠狀

5、結構即消失，微管蛋白熒光強度降低，微管蛋白α亞基表達量增加；缺氧20min后，微管結構性破壞加重，至1h出現微管分布規(guī)律性喪失，微管蛋白熒光強度進一步降低，微管蛋白α亞基表達量進一步增加。 2．缺氧后10min，線粒體未見明顯形態(tài)改變。缺氧20min后，線粒體出現濃縮，不同程度腫脹，嵴模糊甚至溶解，空泡化，胞漿內有聚集的糖原致密顆粒(提示儲積的糖原不能及時轉化為能量，線粒體功能受損)等明顯形態(tài)和結構改變，且隨缺氧時間延長而加重。

6、線粒體功能也出現相應改變。缺氧10min，心肌細胞RCR較正常組顯著降低，但ATP含量變化不明顯；缺氧20 min、30min和1h，隨缺氧時間延長，各組RCR和ATP含量較正常組進一步顯著下降。線粒體活性染色表明，缺氧1h內線粒體的染色活性并未受到嚴重影響。提示缺氧情況下，微管損害略早于線粒體結構與功能損害。 3．單純微管解聚即可使線粒體RCR和ATP顯著降低；缺氧20min、30min、1h后，缺氧解聚組線粒體分布規(guī)律性及形

7、態(tài)結構損害均較單純較缺氧組加重；缺氧20min、30min、1h后，缺氧解聚組心肌細胞RCR、胞漿ATP含量顯著低于單純缺氧組(P值均<0.01)。 三、結論 1．心肌細胞缺氧后10min即可出現微管解聚，提示微管損傷是缺氧心肌細胞損傷的早期事件，且隨缺氧時間的延長而加重。 2．缺氧20min后，線粒體先出現RCR和ATP下降等功能性損害，隨后出現明顯的分布和結構損害，提示缺氧情況下，微管損害略早于線粒體結構與功